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目的:血小板能够促进肿瘤转移,降低血小板数目或者抑制其功能可以明显抑制肿瘤转移。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族的成员,可以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡并抑制部分肿瘤转移。鉴于血小板在肿瘤转移中的作用,本实验观察TRAIL对血小板诱导的结直肠癌侵袭的影响,试图探寻TRAIL抑制肿瘤转移的机制,为更好地发挥TRAIL的抗肿瘤作用提供新思路。方法:1免疫组织化学染色收集2014年7月-2015年11月期间河北医科大学第四医院外二科结直肠癌A/B期(无转移组)与C/D期(有转移组)的患者各30例,取其手术切除标本,制备组织切片;进行CD62P免疫组化染色,以此评价血小板活化情况。2细胞培养取人结直肠癌细胞株HCT116、HT29细胞,在含10%FBS的McCoy’s5A培养液中生长至完全汇合后,用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化传代。3肿瘤细胞侵袭实验利用transwell小室模型,上室分别加无血清培养基悬浮的结肠癌细胞株HT29、HCT116,下室分别加无血清培养基配制的TRAIL、血小板、TRAIL+血小板、抗DR4抗体+血小板、抗DR5抗体+血小板,培养40 h,结晶紫染色后显微镜下观察侵袭的细胞数,比较不同组的差异。4血小板总蛋白提取及Western blot分析血小板分别用PBS和TRAIL室温孵育30 min后,提取蛋白质进行Western blot分析,检测p-p38,p-AKT,p-JNK,p-ERK和DR5/DR4蛋白的表达。5血小板表面受体DR4/DR5的表达分析分别用anti-DR4、anti-DR5抗体与血小板室温孵育,用流式细胞术检测血小板表面相关受体的表达;提取血小板总RNA反转录成c DNA,继而进行Real Time PCR检测;提取血小板总蛋白进行Western blot分析。6 ELISA检测VEGF和TGFβ1的水平用TRAIL处理血小板,分别以PBS和ADP作为阴性和阳性对照,用ELISA检测血小板分泌的VEGF和TGFβ1含量。7小鼠尾部出血实验将TRAIL经腹腔注入小鼠体内,对照组注入等量PBS,2 h后剪断小鼠尾巴,其余的尾巴浸入预温0.9%NaCl,记录自发性出血时间,通过测量预温盐水中的血红蛋白含量来测量出血量。8统计学处理所有数据均采用SPSS 21.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差表示,两样本均数比较采用t检验。计数资料以百分率表示,采用χ~2检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1血小板活性与大肠癌进展分期成正相关用免疫组织化学染色方法分别对临床手术切除的结直肠癌组织进行血小板活化标志物CD62P染色,结果显示,有转移的结直肠癌组织中(C/D期),CD62P的表达显著高于无转移组(A/B期)(P<0.05)。利用transwell小室模型,检测血小板对人结直肠癌细胞株HT29、HCT116侵袭活性的影响,结果显示加入血小板的肿瘤细胞组,其跨膜数目明显多于不加血小板组(P<0.05)。2 TRAIL抑制血小板诱导的肿瘤细胞侵袭细胞侵袭分析结果显示,单独血小板处理组的肿瘤细胞其跨膜迁移的细胞数明显多于对照组(P<0.05);单独TRAIL处理的肿瘤细胞其跨膜迁移的细胞数与对照比较无明显差异;而血小板+TRAIL组的肿瘤细胞跨膜迁移的数目比单独血小板组显著减少(P<0.05);同一刺激下,两种肿瘤细胞之间的侵袭活性无差异。3血小板表面表达TRAIL受体DR5流式细胞术检测结果显示,可检出血小板表达DR5受体;Real Time PCR可检测到DR5 mRNA的表达,但检测不到DR4 mRNA;提取血小板总蛋白进行Western blot,仅检测到DR5蛋白的条带,检测不到DR4蛋白。4 DR5受体介导TRAIL抑制血小板诱导的肿瘤细胞侵袭细胞侵袭分析结果显示,与血小板组相比,抗DR4抗体不影响TRAIL对血小板诱导的肿瘤细胞侵袭的抑制效应;然而,抗DR5抗体预处理的血小板,其抑制效应与TRAIL的作用相同,与单独血小板组比较,肿瘤细胞跨膜迁移的数目明显减少(P<0.05)。5 TRAIL抑制血小板TGFβ1分泌用ELISA检测血小板分泌的VEGF与TGFβ1含量。数据显示ADP处理组VEGF与TGFβ1的含量高于未处理组;TRAIL处理组VEGF的含量与未处理组没有差别,而TGFβ1的含量显著减少。6 TRAIL处理的血小板其信号转导分子的磷酸化水平无明显变化,体内给予TRAIL不影响出血时间和出血量。结论:1血小板活性与临床结直肠癌病理分期成正相关;2 TRAIL抑制血小板诱导的肿瘤细胞侵袭;3血小板表面表达TRAIL受体-DR5,后者介导TRAIL对血小板促肿瘤细胞侵袭的抑制作用;4 TRAIL抑制血小板分泌TGFβ1。