广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth为唇形科刺蕊草属植物,具有芳香化浊,开胃止呕的功效,主要用于治疗胃肠道疾病,其挥发油广泛应用于香水行业,广藿香醇作为广藿香油中最主要的活性成分,具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等生物活性。因此,从基因水平上研究广藿香醇的合成机制,对其合成途径的关键酶进行调控,以期在体外通过发酵工程获得大量广藿香醇。同时通过转基因途径,从植物来源上提高广藿香醇的表达,为进一步利用广藿香药用资源奠定基础。法尼基焦磷酸合酶是广藿香倍半萜合成途径中合成中间体法尼基焦磷酸的关键酶,能够催化异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)生成法尼基焦磷酸等前体物质。本课题组对广藿香叶片进行2代+3代测序,获得广藿香转录组数据;使用逆转录法获得广藿香法尼基焦磷酸基因(FPPS)的cDNA序列,对其进行生物信息学分析,发现广藿香FPPS基因的cDNA全长1 050 bp,编码349个氨基酸,该蛋白的分子量为40 KD,等电点为5.43,蛋白的催化部位由一个大的中心腔组成,该中心腔主要由反平行的α螺旋组成,在中心腔有两个相对的壁,上面富含天冬氨酸富集区(DDXXD)。使用无缝克隆的方法构建pET-28a-FPPS和pET-32b-FPPS原核表达载体,并导入蛋白表达菌株BL21(DE3)中,在不同温度不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)下诱导蛋白表达,结果发现pET-28a-FPPS载体表达的蛋白出现截短,截短10 KD左右,p ET-32b-FPPS载体表达蛋白受温度调控比较明显,20、25℃温度下蛋白大部分表达在上清,30、37℃温度下蛋白大部分表达在沉淀中。选取25℃、130 rmp、1 mM IPTG条件下诱导蛋白大量表达,使用琼脂糖Ni柱对蛋白进行纯化,并使用BCA方法检测蛋白浓度,在IPP和DMAPP的缓冲液中进行酶促反应,反应结束后使用HPLC-MS检测产物,结果发现蛋白酶促反应结果符合预期,产生单萜化合物香叶基焦磷酸和倍半萜化合物α-羟基法尼基磷酸。倍半萜合酶(PTS)是广藿香中合成广藿香醇的关键酶,催化法尼基焦磷酸生成广藿香醇等倍半萜化合物。本研究使用自诱导方式代替IPTG诱导带有pET-32b-PTS载体的BL21(DE3)菌株,获得可溶性的PTS蛋白,蛋白纯化后进行浓度检测,再以法尼基焦磷酸为底物进行酶促反应,结果发现纯化后的蛋白具有活性,能催化底物产生广藿香醇及其他副产物。本课题组前期获得了过表达和反义RNA沉默PTS基因的广藿香植株,但是未对其进行含量检测。本次研究对这两组广藿香进行含量测定,结果发现过表达植株的广藿香醇含量分别比对照组提高了87.6%、47.1%和35.7%(干重),广藿香酮含量下降了59.2%,-20.4%和60.7%;干扰组广藿香醇含量降低了18.0%(干重),广藿香酮含量上升了314.1%。因此推测广藿香醇和广藿香酮可能具有共同前体。同时将PTS基因导入烟草中,获得了转PTS基因的烟草,为后期进一步验证PTS基因功能提供材料。倍半萜合成途径中许多关键基因受到茉莉酸的调控,本研究通过在广藿香叶片上外施茉莉酸甲酯,在7个不同时间段采收叶片,提取RNA后对FPPS和PTS基因进行荧光定量分析,结果发现FPPS和PTS基因受茉莉酸甲酯调控。相对于FPPS,PTS基因表达量受茉莉酸甲酯调控作用更明显;两个基因在48 h时的表达量和对照组差异最显著,0.1 mM茉莉酸甲酯诱导下48 h时的FPPS基因的表达量与对照组相比上调2.53倍,而PTS基因上调4.81倍;0.25 mM茉莉酸甲酯诱导下48 h时的FPPS基因的表达量与对照组相比上调2.20倍,而PTS基因上调4.88倍;并且从FPPS基因的表达趋势可以推测高浓度的茉莉酸甲酯会抑制FPPS基因的表达,低浓度茉莉酸甲酯能促进FPPS基因的表达。