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牛繁缕(Myosoton aquaticum(L.)Moench.)在全国分布普遍,是危害麦类作物的主要杂草之一,稻麦轮作区危害尤为严重。苯磺隆(Tribenuron-methyl)是我国麦田苗后选择性防治阔叶杂草的常用磺酰脲类除草剂,在我国部分麦田应用历史超过20年;由于长期单一使用,在山东、河南、安徽、江苏、湖北等部分地区苯磺隆对牛繁缕的防治效果逐渐下降甚至防除失败,导致小麦严重减产。为明确我国部分地区麦田牛繁缕对苯磺隆的抗性水平及抗性机理,为科学合理防治麦田抗药性牛繁缕提供理论指导,本文以采自山东、河南、安徽、江苏、湖北5个省份的43个牛繁缕种群为研究对象,测定了其对苯磺隆的敏感性,并研究了部分抗性种群对苯磺隆的抗性机理,主要研究结果如下:1.采用整株测定法,应用1倍大田推荐剂量(11.25g ai ha-1)、2倍大田推荐剂量对全部牛繁缕种群进行了抗性筛选,鉴定出敏感种群25个(SD-01、SD-02、HN-01、HN-03、JS-01、JS-02等)、抗性种群18个(SD-03、HN-02、JS-16、JS-17、HB-01、AH-02等)。对其中的17个抗性种群进行了抗性水平测定;测定结果表明,相比敏感种群,17个抗性种群对苯磺隆均产生高水平抗性,抗性倍数在94.7-546.7之间,其中采自江苏省宿迁洋河的JS-17种群抗性水平最高。2.靶标酶ALS离体活性测定结果表明,抗性种群(SD-03、HN-02、HN-04、HB-01、AH-01、AH-02、AH-03、JS-07、JS-08、JS-16、JS-17)ALS对苯磺隆的敏感性较敏感种群显著降低,其IC50为敏感种群的28.9-75.5倍。此外,HN-04、HB-01与AH-01种群ALS总催化活性为敏感种群1.8-2.4倍,其它抗性种群ALS活性与敏感种群(JS-24、HN-03、SD-05)基本一致。3.扩增出敏感种群(HN-03)和抗性种群(HN-07)ALS c DNA全长2280 bp,其开放性阅读框(ORF)2001bp,5’非翻译区(UTR)60 bp,3’非翻译区(UTR)219bp,无内含子,共编码666个氨基酸。Gen Bank登录号分别为KF589890.1、KF589891.1。4.进行了18个抗性种群ALS编码基因的克隆测序,并将其与敏感种群ALS基因序列比对,结果表明抗性种群在Pro197(脯氨酸)发生氨基酸取代:AH-02种群Pro197突变为Glu(谷氨酸),编码碱基由CCG突变为GAG;AH-03种群Pro197突变为Ala(丙氨酸)、Thr(苏氨酸),其编码碱基分别突变为GCG和ACG;SD-03、JS-07、AH-01种群发生Pro197Leu(亮氨酸)取代,编码碱基突变为CTG,此外在AH-01种群进行测序的样品中,鉴定到1株牛繁缕同时发生Pro197Leu与Asp377Glu取代,即天冬氨酸(GAT)突变为谷氨酸(GAG);HN-02、HN-04、HN-05、HN-06、HN-07、HB-01、HB-02、HB-03、JS-08、JS-16、JS-17等13个种群Pro197被取代为Ser(丝氨酸),编码碱基突变为TCG。5.以β微管蛋白基因为内参基因,采用实时荧光定量PCR法测定了抗性种群和敏感种群ALS基因在转录水平的差异,结果表明抗性种群HN-04、HB-01、AH-01、AH-02、AH-03和敏感种群JS-24、HN-03靶标酶基因在转录水平上无显著差异。6.以CDNB为底物研究了敏感种群和部分抗性种群GSTs活性变化。未施药处理组,各种群牛繁缕GSTs活力随时间有一定波动,但差异不大;抗性种群HN-04、JS-07、JS-08的GSTs活力低于敏感抗性种群JS-24、HN-03,抗性种群JS-17的GSTs活力与敏感种群基本一致,但JS-16的GSTs活力高于敏感种群(约1.5倍)。在苯磺隆处理组中,各种群GSTs活力均呈现出先升高后下降的趋势,JS-16种群GSTs活性在第2d达到最高,其它种群均在第3d达到峰值,并且JS-16和HN-04种群GSTs诱导活性高于敏感种群。7.研究了P450抑制剂马拉硫磷(Malathion)对部分种群苯磺隆抗性的影响,结果表明Malathion可增强牛繁缕对苯磺隆的敏感性;较之敏感种群,马拉硫磷可显著降低JS-17种群对苯磺隆的抗性,说明JS-17种群具有更高的P450活性。8.采用整株测定法测定了SD-03、HN-02、HN-04、HB-01、AH-0、JS-16等11个抗性种群对嘧草硫醚、双氟磺草胺、啶磺草胺、氟唑磺隆、咪唑乙烟酸、2,4D丁酯、氯氟吡氧乙酸、异丙隆、吡氟酰草胺等药剂的交互抗性谱。结果表明测定的11个苯磺隆抗性种群均对ALS抑制剂类除草剂嘧草硫醚、啶磺草胺、双氟磺草胺、氟唑磺隆产生了不同程度的交互抗性。其中HB-01、AH-03、JS-07种群对嘧草硫醚产生中等水平抗性(5.0-9.2倍),SD-03、HN-02、HN-04、AH-01、AH-02、JS-08、JS-16和JS-17等种群对嘧草硫醚产生高水平抗性(11.0-109.2倍);AH-02、JS-16、JS-17种群对双氟磺草胺产生高水平抗性(16.6-26.9倍),SD-03、HN-02、HN-04、HB-01、AH-01、AH-03、JS-07、JS-08种群产生中低水平抗性(3.1-9.9倍);除SD-03、HB-01、AH-01等3个种群对啶磺草胺产生中低水平(3.7-6.7)抗性之外,其它测定种群对啶磺草胺产生高水平(11.1-52.9)抗性;测定的9个苯磺隆抗性种群均对氟唑磺隆产生了高水平抗性,抗性水平在10.5-102.2之间;采集于安徽省天长市龙集乡齐田村的AH-02种群对咪唑乙烟酸产生了中水平抗性(8.3倍),但其它10个种群对咪唑乙烟酸依然敏感,抗性水平均小于2.0。此外,牛繁缕对激素类除草剂氯氟吡氧乙酸、2,4-D丁酯,光合系统II抑制剂异丙隆,类胡萝卜素抑制剂吡氟酰草胺敏感(<2.0倍)。9.基于牛繁缕ALS基因测序结果,构建了快速检测牛繁缕ALS等位基因Pro197突变的(d)CAPS方法。以Xho I为内切酶建立了Pro197Ser取代的CAPS分析方法,以Dde I为内切酶建立了Pro197Leu取代的CAPS分析方法,以Nru I为内切酶建立了Pro197Ala取代的CAPS分析方法,以TaqαI为内切酶建立了Pro197Glu取代的CAPS分析方法,通过引物错配碱基引入Apa I酶切位点建立了检测野生型牛繁缕Pro197Pro的d CAPS分析方法。此外,(d)CAPS对牛繁缕ALS基因型鉴定结果与ALS基因测序结果一致。10.以不同ALS等位基因突变纯合生物型牛繁缕植株,研究了Pro197Ser、Pro197Leu、Pro197Ala和Pro197Glu对ALS功能以及植株生长的影响。研究表明突变型牛繁缕与野生型基本一致,其中Pro197Ser牛繁缕的ALS总提取活性最高;各突变未对牛繁缕ALS功能造成明显影响;此外,支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)反馈抑制测定显示,Pro197Leu牛繁缕ALS对异亮氨酸、缬氨酸的敏感性显著增加,Pro197Glu牛繁缕ALS对异亮氨酸的敏感性略有增加,其它突变型牛繁缕ALS对支链氨基酸的敏感性均有不同程度的减弱。相对生长速率测定表明Pro197Ser、Pro197Leu、Pro197Ala和Pro197Glu突变牛繁缕与野生型无显著差异。萌发率测定结果显示抗药性牛繁缕种子萌发时间较野生型晚,且萌发率均低于野生型(Pro197Pro>Pro197Ser>Pro197Glu>Pro197 Leu>Pro197Ala)。本研究明确了我国部分小麦主产区牛繁缕对苯磺隆的抗性水平。抗性机理研究结果表明,ALS基因突变引起的靶标酶对苯磺隆敏感性降低是牛繁缕对苯磺隆产生抗性的主要原因,部分种群对苯磺隆的抗性可能与代谢酶GSTs或P450s活性增强有关。抗性谱测定结果表明不同种群的抗性谱存在一定差异。基于ALS基因序列分析,构建了快速、准确检测牛繁缕ALS基因特定位点突变的(d)CAPS分析方法。此外,本研究初步测定了不同突变对牛繁缕ALS功能和植株生长的影响。