内生真菌(endophytic fungi)是指那些在其生活史中某一段时期生活在植物组织内,对植物组织没有引起明显病害症状的真菌,包括营表生的腐生真菌和对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原真菌和菌根菌。近年来的研究发现,植物内生真菌能产生新的天然产物,甚至可以产生与宿主植物相同或相似的代谢产物,因而成为天然产物的重要来源。本课题对具有重要价值的药用植物人参Panax ginseng C.A.Meyer中的内生真菌进行了较系统的研究。通过对5年生园参和15年生移山参进行内生真菌的分离,总共分离纯化了内生真菌48株(isolates),其中园参内生真菌27株,移山参内生真菌21株;并通过形态及分子生物学方法鉴定了其中40株,鉴定到14个分类单元,将其归属到8科(Mortierellaceae, Hypocreaceae, Nectriaceae, Mucorales, Mucoraceae, Trichocomaceae, Leptosphaeriaceae, Pleosporaceae),10属12种(Mortierella monospora, Trichoderma hamatum, Nectria haematococca, Umbelopsis ramanniana, Mucor circinelloides, Penicillium melinii, Talaromyces intermedius, Aspergillus versicolor, Aspergillus nidulans, Penicillium oxalicum, Penicillium sp., Penicillium polonicum, Leptosphaeria sp.1, Alternaria mali),其中,Trichoderma hamatum为园参内生真菌的优势种,分离概率达23 %,Nectria haematococca为移山参内生真菌的优势种,分离概率达19 %。本课题研究过程中,将内生真菌的发酵液在紫外吸收波长203 nm(2005版药典中人参皂苷的检测波长)进行HPLC检测,发现其中23株真菌的产物显示与人参皂苷类化合物的色谱保留时间及峰型较为一致,因此对其分别进行了LC-MS检测,经选择性离子检测(SIM),其中12株内生真菌与人参皂苷色谱行为较一致,对这12株菌株进行大量发酵、浓缩,分别进行质谱全扫描(SCAN),最终发现待测样品与目标化合物分子量不一致。经过上述实验,未能发现能够产生人参皂苷的内生真菌。以稻瘟霉(Pyricularia oryzae P-2b)为筛选模型,初步筛选内生真菌发酵产物活性,共计48株人参内生真菌中具有完全抑制稻瘟霉活性的菌株占33.3 %(16株)。进一步体外抗真菌、抗肿瘤研究发现,11株(22.9 %)内生真菌产物的抗白色念珠菌(Candida albicans)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、薰烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)活性较好,5株(10.4 %)内生真菌产物的抗胃癌细胞(MKN45)、肠癌细胞(LOVO)、肝癌细胞(HepG2)、白血病细胞(HL-60)活性较好。其中,以菌株Yuan-25(Penicillium melinii)抗真菌活性与菌株Yuan-27(Mortierella monospora)抗肿瘤活性最为显著。菌株Yuan-25(Penicillium melinii)的抗真菌、抗肿瘤活性均较显著,并且形态特别、具有特殊气味,故对其内生真菌发酵产物和宿主园参进行乙醚部位的GC-MS检测。实验发现两者有共同化合物——人参炔醇(falcarinol, panaxynol),一种抗肿瘤活性物质。此外,Yuan-25(Penicillium melinii)的乙醚部位还存在一些生物活性物质,如苍耳素(xanthatin),异丹参酮Ⅱ(isotanshinoneⅡ)等。从以活性筛选为导向得到的活性菌株中,选择了生物活性显著、产量高、相对稳定的5株:Yuan-13(Penicillium sp.)、Yuan-25(Penicillium melinii)、Yuan-27(Mortierella monospora)、Yuan-30、YSS-13(Alternaria mali),进行化学成分研究;同时对抗肿瘤活性化合物的作用机理进行初步探讨。以抗稻瘟霉活性为指导,利用现代色谱方法和波谱学技术,已从人参内生真菌的活性部位——乙酸乙酯相,分离并鉴定出了9个化合物,分别命名为:(1)人参菌素(2,4-二羟基-3-甲基-6-[(Z)-(6-甲基-5,6-二氢-2H-吡喃-2-亚基)甲基]-苯甲醛);(2)蓝菌素(Brefeldin A);(3)2,4,5-三甲基-1,3-苯二酚;(4)2,4-二羟基-3,5,6-三甲基苯甲酸甲酯;(5)甘露醇(mannitol);(6)青霉酸(Penicillic acid);(7)麦角甾醇(ergosterol);(8)过氧麦角甾醇(ergosterol peroxide);(9)对羟乙基苯酚(tyrosol)。其中,人参菌素为未报道过的新化合物,而蓝菌素为具有重要科研及经济价值的化合物,两者均表现出较好的生物活性,具有重要的研究开发价值。本研究分离得到的内生真菌次生代谢产物均与人参中已报道的成分不同。通过以上研究,得到一些有意义的结果,主要包括:(1)从人参中分离得到48株内生真菌,对部分菌株进行了鉴定,并且筛选出了若干生物活性较好的菌株(Yuan-25、Yuan-27、Yuan-30、Yuan-31、YSS-13等),表明人参内生真菌物种多样性丰富,是庞大的微生物资源库;(2)菌株Yuan-25(Penicillium melinii)的乙醚部位生物活性较好,具有丰富的化学成分,并能产生与宿主相同的成分——人参炔醇(falcarinol, panaxynol);(3)分离获得5株生物活性较强、产量较高、相对稳定的内生真菌,通过柱层析对这5株内生真菌的发酵产物进行分离纯化,得到单体化合物14种,最终鉴定出9种化合物,均与人参中已报道的成分不同;(4)Yuan-25-1为新化合物,且活性较显著,进一步表明内生真菌是重要的新药资源库;(5)发现一株Brefeldin A的高产菌株——菌株Yuan-27(Mortierella monospora),与以往的研究报道比较,本菌株的Brefeldin A产量大(180 mg/g),且生产工艺简单,成本相对低廉。综上所述,本课题为开发应用人参内生真菌及其活性产物提供了一定的理论和化学基础。