目的:本课题以抗人上皮特异性黏附分子（epithehal cell adhesion molecule,EpCAM）单抗的scFv为胞外单链可变区,其序列包括Kozak序列和CD8α信号肽序列,CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28信号区、CD137信号区、CD3ξ信号区。以LV5为慢病毒载体,构建一种靶向结直肠癌抗原EpCAM的第三代嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）,用于转染T细胞以构建靶向EpCAM抗原的CAR-T细胞（抗EpCAM-CAR-T）,同时研究抗EpCAM-CAR在T细胞上的表达情况。探讨抗EpCAM-CAR-T对EpCAM抗原表达阳性和阴性的肿瘤细胞的体外杀伤作用,并观察T细胞杀伤性细胞因子的分泌情况。探讨抗EpCAM-CAR-T细胞对结直肠癌荷瘤裸鼠的体内治疗效果,观察裸鼠血清杀伤性细胞因子分泌情况,并初步分析抗EpCAM-CAR-T治疗后的相关副作用。方法:（1）确定抗人EpCAM单抗的scFv序列及相关的序列信息,通过基因全合成的方法将所有序列合成一个整体序列:CD8α信号肽-抗EpCAM-scfv-CD8铰链区-CD28跨膜区-CD28信号区-CD137信号区-CD3ξ信号区。然后将EpCAM-CAR克隆到LV5慢病毒载体,通过三质粒系统转染293T细胞,制备成慢病毒,DNA测序检测序列是否正确。（2）T细胞的扩增培养,提取外周血单个核细胞,用CD28和CD3激活后,用含有白介素-2（IL-2）的GT-T551完全培养基培养,利用流式细胞术检测CD8+和CD4+的T细胞比例。（3）转染后的EpCAM-CAR-T细胞利用流式细胞术检测EpCAM-CAR是否表达。在EpCAM-CAR-T构建完成后进行体外杀伤实验。（4）将EpCAM-CAR-T细胞与EpCAM表达阳性和阴性的细胞共培养,之后用MTT法检测杀伤效率,并用ELISA法检测杀伤性细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与干扰-γ（IFN-γ）的分泌情况。（5）将BALB/C裸鼠分为四组,每组6只,应用HT-29结直肠癌细胞腹腔种植BALB/C裸鼠的肿瘤模型,研究EpCAM-CAR-T对结直肠癌的体内抑制作用,记录裸鼠死亡率及肿瘤大小,将肿瘤组织行病理切片观察病理变化,并检测裸鼠血清杀伤性因子的分泌情况。（6）同时对荷瘤小鼠的肝肾进行病理切片,观察是否产生相关的副作用。结果:（1）成功构建了靶向EpCAM抗原的嵌合抗原受体LV5-EpCAM-CAR,并进行了慢病毒包装,DNA测序与预想结果符合。（2）提取的外周血单个核细胞,经激活和培养后,T细胞大量扩增,CD3^+、CD8⁺和CD4⁺的T细胞比例在60%以上。（3）转染后,流式细胞仪检测EpCAM-CAR在T细胞膜上的表达率为19.7%。（4）MTT结果发现EpCAM表达阳性组的肿瘤抑制率比阴性组高（P<0.05）,ELISA结果提示阳性组的杀伤性细胞因子TNF-α与IFN-γ的分泌量比阴性组高（P<0.05）。（5）裸鼠造瘤七天后,皮下出现结节,腹部稍膨胀,按压腹部可触及大小和数量不等的肿块,病理切片证实为结直肠癌。实验发现空白组从第16天开始出现死亡,对照组在第18天,死亡裸鼠腹部极度膨胀,而CAR-T组第26天时才开始死亡,腹部几乎没有膨胀,肿瘤体积也比空白组和对照组小（P<0.05）,空白组与实验组的死亡率有明显差别（P<0.05）,但实验组和对照组在第28天的存活率相同。实验组荷瘤裸鼠血清杀伤性细胞因子TNF-α与IFN-γ的分泌量比空白组和对照组高（P<0.05）（6）裸鼠的病理切片观察发现各组肝肾未见明显转移癌出现,但死亡裸鼠的肝组织病理切片可见有色素沉着、细胞萎缩等恶病质变化,说明治疗可能产生脱靶效应造成了细胞因子风暴,实验组裸鼠可能是死于此副作用。结论:成功构建了一种第三代嵌合抗原受体结构EpCAM-CAR,转染EpCAM-CAR后的T细胞可以靶向识别EpCAM阳性的肿瘤细胞,并能分泌大量的杀伤性细胞因子TNF-α与IFN-γ,在体内也可较好地抑制结直肠癌的生长及转移,并改善荷瘤裸鼠的生存质量。EpCAM-CAR同时也会产生脱靶效应而引起细胞因子风暴,需要在治疗中结合免疫抑制剂和丙球蛋白等手段来降低副作用。