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蚊媒黄病毒作为黄病毒属中以蚊虫为传播媒介,鸟、猪、猴、人等为终末宿主的病原体,在全球和中国部分地区流行和蔓延,严重威胁了人类的健康。开展病毒特异性快速检测技术和抗病毒药物的研究,对蚊媒疾病的预防和控制具有重要意义。本论文在比较黄病毒核酸序列的基础上,建立了特异性检测登革1~4型病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒和黄热病毒等蚊媒黄病毒RT-PCR和液相芯片检测技术法,并开展了黄病毒非结构蛋白5(NS5)的抗原和抗体制备及其特异性比较分析,为蚊媒黄病毒核酸和抗体特异性检测及检测试剂盒研发提供了技术基础。
本论文建立的蚊媒黄病毒RT-PCR特异性检测方法,可以用于特异性检测登革1~4型病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒和黄热病毒,灵敏度分别为5.09×104拷贝、4.35×104拷贝、4.72×104拷贝、1.73×104拷贝、2.47×104拷贝、3.65×103拷贝和5.16×103拷贝。在此基础上设计了D1P-C,D2P-C,D3P-C,D4P-C,WNVP-C,JEVP-C和YFVP-C探针用于建立蚊媒黄病毒液相芯片特异性检测技术。经验证,此技术检测7种病毒的灵敏度最高可达5.09×102拷贝。混合探针检测特异性评价表明D1P-C,D2P-C,D3P-C,WNVP-C,JEVP-C和YFVP-C6种混合探针在检测已知来源的32份cDNA样品时,准确度达90.9%,特异度达100%。而用于检测登革4型病毒的D4P-C更适合用于单个探针的特异性检测。
完成了登革1~4型病毒,西尼罗病毒,日本脑炎病毒和黄热病毒NS5蛋白的表达和纯化,制备出相对应的抗体。Western Blotting分析表明,WNV NS5蛋白具有高的抗原特异性,而DENV2和JEV的NS5抗体具有较高的抗体特异性,表明不同黄病毒NS5可能存在着特异免疫位点。研究结果为今后特异性抗原和抗体的制备提供新的思路。