PCV2b B细胞表位嵌合亚单位疫苗在E.coli中的制备和免疫评价

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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)主要感染6-18周的断奶仔猪,造成机体的免疫系统抑制,从而引起多种病原体的混合感染,导致猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus association disease,PCVAD)的发生,给养猪业带来巨大损失。疫苗是防控PCV2感染的有效手段,在PCV2的11个潜在开放阅读框(Open reading frames,ORFs)中,ORF2编码PCV2唯一的结构蛋白(Capsid,Cap),分子质量大小在28 k Da左右,是疫苗开发的理想靶抗原。目前,国内外学者对PCV2疫苗研究方面做了大量的研究工作,已研制成功了多种基于PCV2a/b亚型的商业化疫苗,主要是灭活苗、亚单位疫苗,但价格居高不下,且当下可能正在发生PCV2流行亚型的转变,因此有必要开发出廉价有效的PCV2亚单位疫苗。SUMO标签具有促进蛋白可溶表达和提高表达量的特性,根据大肠杆菌对密码子的偏好性合成PCV2b(Gen Bank:AY969004.1)cap基因全序列,利用PCR技术分别将PCV2的2个B细胞表位(195HVGLGTAF202226LKDPPLNP233)以单独和串联的方式连接到Cap的C端,并构建至p E-SUMO表达载体,转化至表达菌株BL21(DE3)表达,经SDS-PAGE和Western blotting验证,3种嵌合蛋白均正确表达。蛋白表达条件优化后发现,在26℃、诱导剂终浓度为0.5 mmol/L的条件下诱导培养8 h,目的蛋白大部分以可溶形式表达,对3种嵌合蛋白进行亲和层析纯化并酶切去除标签,获得的无标签的3种嵌合蛋白(Cap-e1、Cap-e2、Cap-e12)均能在组装液中形成病毒样颗粒,直径大小在23 nm左右,略大于ΔNLS-Cap形成的病毒样颗粒。之后将3种嵌合蛋白分别与相应的弗氏佐剂等体积乳化,把20只6周龄大小的雌性Balb/c小鼠随机分成5组,每只小鼠免疫30μg/100μl,同时设置PBS组和疫苗组作为阴性对照和阳性对照,每2周免疫一次,共免疫3次,在第2周、第4周和第6周断尾采血,用PCV2抗体检测试剂盒检测抗体的变化趋势,比较在PCV2 Cap的C末端连接不同B细胞表位对Cap免疫原性的影响。抗体检测结果表明,除第2周外,各试验组的抗体水平均显著高于PBS组,且连接2个表位的Cap-e12蛋白产生的抗体水平均显著高于只连接1个表位的蛋白(Cap-e1、Cap-e2),在3免2周后,Cap-e12蛋白抗体水平持续上升,与疫苗组无显著差异,利用IPMA测定的中和结果表明,Cap-e12的中和能力显著高于Cap-e1和Cap-e2。综上,连接2个表位后能显著提高Cap的免疫原性和中和活性。这为PCV2新型亚单位疫苗的研制提供了一定的参考。
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