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一、研究背景神经病理性疼痛是多种中枢或外周神经系统病变,比如神经外伤、慢性癫痫、带状疱疹、糖尿病、髓核脱出、炎症和感染的常见并发症。临床上病人常有疼痛过敏、疼痛超敏、异常痛觉等不适情绪和感觉,其产生的病理基础主要是神经元广泛去极化和细胞内钙超载。大电导的钙激活钾通道(BKca)在脊髓背根神经节各种直径的神经元上均有分布,通过激发对Ca2+内流敏感的外向性K+电流调节细胞兴奋性和神经元放电。既往研究表明,BKca介导的AHP电流在结扎的L5脊神经支配DRG上明显削弱,而在临近的L4支配DRG上明显增强。在体外实验中也发现BKca激活可以抑制4-AP和去极化引起的神经元过度兴奋,证实了BKca功能抑制在增强去极化频率和幅度、调节峰电位间期及频率适应性、调控神经递质合成释放上的作用和地位。但是在外周神经损伤后,BKca通道的表达和分布是否发生可塑性改变,国内尚鲜有研究。本实验拟建立改良的慢性坐骨神经缩窄损伤模型,观察NPP状态下BKca-α亚基在脊髓DRG神经元上的改变。二、目的本研究观察不同的坐骨神经损伤模型对动物疼痛行为和氧化应激水平的影响。并选择改良后的iCCI模型,检测BKca-α亚基在脊髓损伤节段DRG神经元上的分布和表达改变,探讨其参与疼痛发生的可能机制和作用。三、方法实验分二部分:1.神经病理性疼痛大鼠模型的制作、评估和筛选雄性SD大鼠60只,随机分为4组(Sham组,n=15)、传统坐骨神经结扎组(传统CCI组,n=15 )、改良坐骨神经结扎组(iCCI组,n=15),坐骨神经分支选择性损伤组(SNI组,n=15 )。Sham组仅暴露坐骨神经,CCI组、iCCI组和SNI组分别参照文献报道方法于右后肢行手术操作,制作疼痛模型。比较术前及术后1, 3, 7, 10, 14, 17, 21d各组大鼠的机械/热缩足阈值差异,并在术后7, 14,21d处死各组大鼠各5只,检测脊髓L4~L6节段损伤侧SOD、MDA含量。2.改良的iCCI模型脊髓DRG神经元上BKca-α亚基的mRNA及蛋白的表达检测雄性SD大鼠105只,均分为7组:iCCI组(iCCI处理7d,14d,21d组,n=15),Sham组(假手术处理7d,14d,21d组,n=15),正常对照组(Control组,n=15)。按照文献方法建立筛选疼痛模型后,分组在规定时间点处死大鼠,采用RT-PCR技术测定L4-6脊髓DRG上BKca-α亚基mRNA水平;Western blotting和免疫组化测定L4-6节段DRG上BKca-α的蛋白表达和阳性免疫产物分布情况。四、结果1.热/机械痛阈检测:Sham组的热/机械痛阈在术前及术后各时间点没有统计学差异(P >0.05)。CCI和iCCI组在术后第7天即出现明显的热/机械痛阈降低,并在术后第14天达到最低值( P <0.01)。iCCI组比CCI痛阈下降更加显著( P <0.05)。SNI疼痛模型仅对机械刺激敏感而对热刺激不敏感。2.氧化应激改变:术后7,14,21d发现三种模型脊髓损伤侧SOD水平明显下调,MDA表达显著上调,各指标变化幅度iCCI >CCI > SNI>Sham。iCCI大鼠因坐骨神经结扎和异物刺激导致的氧化应激强度改变在三种疼痛模型中最显著( P <0.05)。Sham组手术前后SOD/MDA水平改变没有统计学意义(P >0.05)。3.BKca-α表达改变:正常和Sham组间BKca-α表达水平无统计学差异,但是CCI组DRG上BKca-αmRNA和蛋白表达明显下调,并重分布( P <0.05)。BKca-αmRNA的表达水平变化和大鼠热/机械痛敏增加的变化规律基本一致。五、结论1.三种NPP模型的疼痛规律和氧化应激水平各不相同,iCCI大鼠的氧化应激和异常痛敏增高比传统CCI、SNI更明显,提示iCCI模型是一种更加典型、稳定的疼痛模型。2.外周神经损伤导致大鼠脊髓DRG神经元上BKca-α表达下降,可能削弱了BKca对神经元兴奋的负反馈,参与了大鼠的脊髓敏感化和痛觉过敏的形成,在大鼠神经病理性疼痛中发挥重要作用。