喉癌是喉部最常见的恶性肿瘤，占全身肿瘤的5.7%-7.6%,喉癌的发病率目前有逐年提高的趋势，同其他恶性肿瘤一样，喉癌发病的确切病因尚不清楚，可能是多种因素综合作用的结果，例如吸烟、饮酒、空气污染、病毒感染以机体内微量元素的变化等，在众多因素中，癌基因的激活和抑癌基因的失活逐渐成为研究的重点，例如抑癌基因的突变，可导致细胞发生癌变。 尽管近年来手术、化疗和放疗技术有了明显的提高，但喉癌总的生存率仍很低，尤其对复发型喉癌疗效不容乐观，因此人们一直在不断地寻求新的更有效的治疗方式。基因治疗作为分子治疗的一种手段，对恶性肿瘤显示出良好的应用前景。越来越多的研究表明恶性肿瘤的发生发展与细胞凋亡、增殖调节失控密切相关。本研究主要内容有三方面：①抑癌基因PTEN在喉癌中的表达及外显子5、8的突变；②凋亡相关蛋白酶Caspase-3在喉癌中的表达；③PTEN 、Caspase-3、PCNA在复发型喉癌中的表达及临床意义。 抑癌基因PTEN第5、8外显子在喉癌中突变的实验研究我们首先根据Gene Bank设计并合成了抑癌基因PTEN第5、8外显子引物， 从新鲜人喉鳞状细胞癌组织中成功地提取了基因组DNA，利用我们所合成的引物，采用PCR的方法扩增出了抑癌基因PTEN第5外显子及第8外显子的全长cDNA片段，长度分别为253bp和233bp。将获得的抑癌基因PTEN第5、8外显子片段克隆入pMD18-T质粒，重组质粒载体分别以EcoR I、HindⅢ酶切，并分别释放出两条长约310bp和290bp的片段。将重组质粒的插入片段经DNA自动测序仪进行序列分析，<WP=100>结果表明，60例喉癌患者中PTEN基因第5外显子发生突变者5例，第8外显子发生突变者2例，突变率为11.7%。 1例第5外显子第474位碱基发生A→T的颠换。1例第5外显子第397、407位碱基发生G→A的转换 ，导致错义突变，使其编码的氨基酸由缬氨酸和半胱氨酸变成异亮氨酸和酪氨酸；1例第5外显子第405位碱基发生A→T的颠换。另外有1例上述四个位置都发生了突变。1例第8外显子第830位碱基发生C→T的转换，导致错义突变,使其编码的氨基酸由苏氨酸变成异亮氨酸；1例第8外显子第830位碱基发生C→T的转换，第831位碱基发生A→C颠换。而应用免疫组化研究发现，喉癌中PTEN蛋白的阳性表达率为58.3%（35／60），而正常喉粘膜及癌旁组织PTEN蛋白的阳性表达率分别为100%（10／10）和95%（19／20）。这说明PTEN基因的失活或低表达可能在喉癌的发生发展中起重要作用。PTEN基因的外显子5及外显子8的突变可能在PTEN基因的低表达方面起了一定作用，但并不是决定性的。 二、凋亡相关蛋白酶Caspase-3在喉癌中的表达及临床意义我们应用免疫组化的方法研究Caspase-3在喉癌中的表达，标本取自1991~1998年5月吉林大学第二医院耳鼻咽喉科经病理证实且临床资料完整的喉癌石蜡包埋标本289例，另取正常喉组织20例（喉外伤16例，尸体标本4例），声带不典型增生60例（门诊手术室留取）作为对照。其中声门型134例、声门上型109例、声门下型27例、跨声门型19例；T1期58例、T2期61例、T3期117例、T4期53例；高分化203例，中低分化86例。全部患者术前未接受放疗、化疗及手术治疗。其中男238例，女51例。年龄35～81岁，平均56.6岁。结果表明，caspase-3主要表达于细胞质，少部分细胞核中也有表达。正常喉粘膜中caspase-3高表达，与喉癌相比具有统计学意义。在与临床病理因素的关系中，caspase-3的表达与临床分期、组织分化以及淋巴结转移密切相关，而且caspase-3阳性表达组5年生存率明显高于阴性表达组，这些结果表<WP=101>明caspase-3表达与喉癌的发生、发展以及预后有密切关系。鉴于caspase-3在细胞凋亡中的重要作用，喉癌中的低表达意味着喉癌细胞凋亡减少，生长旺盛，侵袭力增加，而喉癌中caspase-3表达阳性，提示癌细胞分化程度高，细胞凋亡调控机制障碍程度轻，癌细胞增殖较弱，患者预后较好，这一点在患者5年生存率上有所体现。caspase-3阳性患者的预后明显好于阴性表达者，caspase-3可以作为喉癌临床评价肿瘤生物学行为及判断预后的有用指标之一。另外，我们探讨了caspase-3表达与PTEN表达之间的关系，发现caspase-3阳性表达的患者PTEN的表达大部分是阳性，这说明PTEN在抑制喉癌细胞增殖和促进其凋亡方面发挥了一定作用， PTEN表达阳性说明细胞凋亡调控机制障碍程度轻，细胞凋亡相对增加，caspase-3表达也随之增加。虽然caspase-3表达与PTEN表达之间在统计学上存在这种共性关系，但是二者之间是否具有明确的关联，有待进一步证实。三、PTEN 、Caspase-3、PCNA在复发型喉癌中的表达及临床意义喉癌治疗后复发在临床上较为常见，可分为局部复发、区域复发（颈淋巴结复发）以及远处转移。在1999年全国喉癌喉功能保留手术学术会议上提到术后失败原因为局部复发和区域复发（颈淋巴结复发）。本文回顾了近10年来在我院手术后复发的喉癌患者（包括局部复发和区域复发）的临床资料，并结合PTEN、Caspase-3以及PCNA的表达来分析复发型喉癌的细胞生物学特征，探讨三者在预测喉癌术后复发危险度方面的作用。标本取自1991~1998年吉林大学第二医院耳鼻咽喉科经病理证实、临床资料完整且术后复发的?