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胶质母细胞瘤被认为是最恶性的脑肿瘤,其具有的高度特异性和浸润生长特性,使得肿瘤进展快、恶性程度高。当前治疗手段面临治疗效果差、临床预后差和易复发等困境,因此针对胶质母细胞瘤的诊断及治疗亟待发展新的有效途径。目前大数据组学研究等生物信息学技术的深入发展,为筛选和鉴定在胶质母细胞瘤侵袭、恶性增殖等病理过程中起重要作用的关键新靶点提供了平台与可能。在本研究中,通过多组学芯片数据筛选并结合本中心临床病例,我们发现瞬时受体势离子通道TRPM8在胶质母细胞瘤中显著高表达,而且是患者预后差的一个直接相关因素。采用一系列细胞生物学方法,我们深入研究了TRPM8在胶质母细胞瘤的细胞增殖、侵袭和凋亡中的功能及作用机制。应用权重基因共表达网络分析、GEO2R等生物信息学技术,我们还发现miR-433是胶质母细胞瘤中一个与正常脑组织相比显著下调的miRNA。进一步通过分子生物学等实验,发现筛选出的靶miR-433与TRPM8之间存在较好的靶向关系而且miR-433高表达可通过靶向TRPM8抑制胶质母瘤细胞的侵袭能力。总之,本研究发现了TRPM8、miRNA-433等基因在脑胶质瘤的细胞增殖、侵袭和凋亡中的作用,并初步揭示了其作用的分子机制,从而为胶质母细胞瘤的药物和基因治疗提供了潜在的分子靶标。第一部分:胶质母细胞瘤患者预后相关基因TRPM8的生物信息学筛选目的:从GEO数据库中筛选出胶质母细胞瘤中具有预后判断潜能的新分子,通过本中心临床病例验证靶基因TRPM8在胶质母细胞瘤中的表达情况及其在胶质母细胞瘤患者预后中的作用价值。方法:从GEO数据库筛选出符合条件的微阵列数据集,并应用在线GEO2R分析工具筛选出胶质母细胞瘤肿瘤组织和正常脑组织样本之间的差异表达基因。随后,对这些差异的基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。利用Cytoscape软件构建蛋白互助网络和筛选枢纽基因。利用基于TCGA数据库的GEPIA数据库和Oncomine数据库对这些枢纽基因表达水平进行验证,并通过CGGA数据库对这些枢纽基因进行预后生存分析。另收集本中心的71例胶质母细胞瘤病例及11例正常脑组织,通过对组织芯片免疫组化和RT-PCR验证感兴趣的基因在肿瘤组织中是否高表达,并对纳入的病例密切随访,进行Cox回归模型多因素分析和Kaplan-Meier生存分析。结果:三个芯片数据(GSE50161、GSE4290、GSE68848)符合筛选条件,它们共同表达的差异基因有716个,其中188个基因为显著上调的基因,528个基因为显著下调的基因。从这些差异基因中筛选出其中10个关联度最好的枢纽基因。通过TCGA和Oncomine数据库分析验证发现这10个枢纽基因在胶质母细胞瘤中的表达明显均高于正常组织。通过使用CGGA数据库对上述10个枢纽基因进行预后生存分析发现其中6个基因(TOP2A、CDK1、CDC20、BIRC5、MELK和TRPM8)与胶质母细胞瘤患者的临床预后密切相关。进一步通过本中心病例样本对TRPM8表达水平进行验证,亦证实TRPM8在胶质母细胞瘤中较正常脑组织中表达显著升高(P<0.0001)。同时COX多因素分析结果提示TRPM8是胶质母细胞瘤一个独立的危险因素(P=0.012),并且预后生存分析结果可见高表达TRPM8的胶质母细胞瘤患者总体生存期更短。结论:TOP2A、CDK1、CDC20、BIRC5、MELK和TRPM8可作为评判胶质母细胞瘤患者有价值的生物标志物。TRPM8在胶质母细胞瘤中显著高表达且是影响胶质母细胞瘤预后的一个独立危险因素。第二部分:TRPM8在胶质母细胞瘤的细胞增殖、侵袭和凋亡中的功能和机制研究目的:通过分子生物学实验明确TRPM8在胶质母细胞瘤的细胞增殖、侵袭和凋亡中的功能及作用机制。方法:采用RT-PCR和Western blot检测胶质母细胞瘤细胞系(U251、U87-MG、A172)和正常星形胶质细胞HA1800中基因TRPM8中m RNA和蛋白表达水平。运用膜片钳全细胞记录和Ca2+成像检测胶质母细胞瘤细胞系中的TRPM8通道活性特点。设计、合成靶向TRPM8的小片段干扰RNA(siRNA),利用Lipofectamine2000将质粒转染进入细胞,在U251细胞中转入过表达TRPM8的质粒。通过CCK-8增殖实验、划痕实验、Transwell侵袭实验、细胞流式检测实验分别检测胶质母细胞瘤细胞的增殖和侵袭、凋亡等功能。Western blot和细胞免疫荧光法检测TRPM8表达水平改变后U251细胞中的细胞外调节蛋白激酶(extracellular singnal-regulated kinase,ERK)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和Bcl-2的表达情况。结果:胶质母细胞瘤细胞系较正常星形胶质细胞系中TRPM8表达量明显升高(P<0.05),膜片钳电生理和Ca2+荧光成像结果表明胶质母细胞瘤细胞中的TRPM8通道是功能性的且具有外向整流的特性。CCK-8检测结果显示TRPM8可以正向调节胶质母细胞瘤的细胞增殖能力。划痕实验及Transwell侵袭实验结果表明胶质母细胞瘤的细胞侵袭迁移能力与TRPM8的表达水平呈正相关(P<0.001)。流式细胞检测结果发现TRPM8表达水平反向调节U251的细胞凋亡率(P<0.01)。Western blot和细胞免疫荧光结果提示过TRPM8表达水平可以降低U251细胞中ERK、Cyclin D1和Bcl-2表达水平。结论:Ca2+可渗透的非选择性阳离子通道TRPM8促进了神经胶质母细胞瘤的细胞增殖和侵袭,同时TRPM8降低神经胶质母细胞瘤细胞对凋亡的敏感性,其机制是通过调节MAPK信号通路来完成。第三部分:miR-433靶向TRPM8基因抑制胶质母细胞瘤的细胞侵袭能力目的:研究miR-433与TRPM8之间的靶向关系,并探讨miR-433对胶质母细胞瘤的细胞侵袭能力的影响。方法:通过从GEO数据库筛选出符合条件的miRNA表达数据集,进一步采用基于R语言的WGCNA包构建该芯片数据集的共表达网络模型,识别与疾病状态相关的模块并对该相关模块进行枢纽miRNA筛选;利用另一个芯片GSE13030得到的差异miRNA,并与枢纽miRNA取交集得到目的miRNA。通过生物信息学和荧光素酶基因报告验证目的miRNA与TRPM8的靶向关系并采用Western blot分析miRNA过表达对TRPM8蛋白水平的影响。采用划痕实验和Transwell侵袭实验检测miR-433过表达对体外胶质母细胞瘤细胞侵袭能力的影响。结果:本研究将符合条件的芯片GSE25631运用生物信息学的方法最终筛选出miR-433。双荧光素酶报告基因报告证实TRPM8基因是miR-433的潜在靶基因。蛋白质印迹法进一步证实miR-433能够调节TRPM8的蛋白表达水平。划痕实验显示,miR-433 inhibit组的胶质瘤细胞(A172、U251、U87-MG)的迁移能力明显高于对照的NC组,而miR-433 mics组的细胞迁移能力显著劣于NC组(P<0.01),NC组之间没有显着差异(P>0.05)。Transwell侵袭实验可见miR-433 inhibit组的A172、U251、U87-MG细胞中的侵袭能力显著高于NC组(P<0.01),但miR-433mics组的侵袭细胞数明显少于NC组(P<0.01),NC组之间亦无显着差异(P>0.05)。结论:筛选出的靶miR-433与TRPM8之间存在较好的靶向关系。miR-433高表达可通过靶向TRPM8抑制胶质母瘤细胞的侵袭能力,这一机制为胶质母细胞瘤的基因治疗提供新的策略。