乙型肝炎病毒免疫吸附方法学研究

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乙型肝炎(hepatitis B,HB)是全世界都面临的重大的肝脏类疾病,主要是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染而引发的疾病,包括急性和慢性肝炎,一些慢性肝炎患者会发展为肝硬化或肝癌等。目前全球大约有4亿人感染乙型肝炎病毒,其中75%以上主要分布在亚洲和太平洋地区,每年因为乙型肝炎引发的疾病死亡人数约有100万。现在针对乙型肝炎的治疗方式主要有疫苗预防和药物治疗,疫苗预防是最有效的方法,药物治疗包括干扰素类似药物以及核酸类药物等,但是,这些药物主要是抑制病毒活性和减少病毒复制,长期服用会产生耐药性,针对乙型肝炎的治疗以及乙型肝炎病毒的清除仍是现在研究的重点。免疫吸附疗法是一种新的治疗技术,主要用于治疗一些传统方法难以治疗的疾病,其原理主要是在载体上固定一定的抗体、抗原或者是某些具有特异性吸附性能的配基,利用配基的吸附性能,将患者血液中的毒蛋白或者其他内源性致病因子选择性或者特异性的清除,进而达到净化血液,缓解病症和治疗疾病的目的,现在该疗法在免疫性疾病的临床治疗中得到了较好的效果,如系统性红斑狼疮,重症肌无力,风湿性疾病等。在本研究中,将免疫学和血液净化理论结合,以交联琼脂糖(Sepharose 6FF)微球为固定载体,利用该载体表面的丰富的羟基基团,运用化学交联剂,溴化氰(CNBr),羰基二咪唑(CDI),环氧氯丙烷(ECH),高碘酸钠(Na IO4)等交联剂对羟基进行活化改性,并验证筛选高碘酸钠氧化法抗体高固定率(79%),活化微球抗体的吸附能力为0.96mg/ml,同时,该方法易操作性以及高稳定性等优点作为最佳的活化方法。针对不同抗体的吸附验证研究中,通过对anti-HBs,以及HBIG两种配基固定并通过HBs Ag阳性血浆的吸附验证,HBs Ag以及HBV DNA拷贝数均有降低,其中,anti-HBs对HBs Ag吸附率最高,吸附能力为11.9μg/ml,减少了血浆中乙型肝炎病毒数量。同时,对吸附剂的稳定性脱落性以及灭菌方式进行分析,微球脱落较少,通过对辐照灭菌、环氧乙烷灭菌以及间歇式湿热灭菌比较分析,得出,辐照灭菌在3k Gy 85%,10k Gy 60.9%。环氧乙烷灭菌方式吸附剂活性回复率为50.9%,60℃间歇式湿热灭菌后,吸附剂活性回复率平均达到89.8%,能够更好的保持吸附剂对病毒的吸附特性。免疫吸附方式一定程度上降低了血液中的病毒的HBs Ag浓度和病毒DNA拷贝数,HBs Ag作为乙型肝炎病毒筛选的重要指标,降低率可达80%,同样反应了乙型肝炎病毒数量的降低。同时对吸附前后血浆中其他指标进行检测,乙型肝炎相关指标:如HBs Ab,HBe Ag,HBe Ab,Hbc Ab;血浆中离子:钠,钾,氯,钙;血浆中蛋白,总蛋白,肌酐,总胆固醇,血清白蛋白等指标在通过免疫吸附剂吸附处理之后数值仍在正常参考值范围之内。同时,研究中通过模拟体外连续性血液净化(continuous blood purification,CBP),组装吸附柱(吸附剂60m L,抗体10mg)建立体外血浆循环吸附方式,通过对血浆的5次循环吸附处理,血浆中的HBs Ag,DNA拷贝数均逐渐降低,循环次数的增加,血浆中HBs Ag吸附量增加,部分血浆出现HBs Ag检测为阴性。同时,从免疫吸附剂材料来源,配基的筛选,如其他类型受体,适配子,以及对乙型肝炎病毒免疫吸附柱应用的可行性进行探讨。
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