论文部分内容阅读
文心兰(Oncidium spp.)为兰科文心兰属植物,是热带气生兰,因其花形独特、花姿优美、花色亮丽,而倍受人们的喜爱,市场需求量正迅速增长。本研究以“小樱桃”文心兰试管苗的叶片和根切段为材料诱导原球茎,建立文心兰高效再生系统和受体系统,并采用根癌农杆菌介导法对文心兰原球茎进行ACS反义基因遗传转化的研究。主要研究结果如下:1.文心兰高效再生系统的建立。以文心兰试管苗的叶片和根切段为材料,研究了文心兰再生系统建立的有效途径。试验结果表明,文心兰叶片在1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培养基上,原球茎诱导率达72.6%,优于根切段在此培养基上的诱导率,因此叶片适宜作为文心兰原球茎的诱导材料;以MS为基本培养基时,BA、NAA浓度分别为2.5 mg/L、0.5 mg/L或2.0 mg/L、0.5 mg/L时,原球茎增殖系数高;原球茎分化的最适培养基选择1/2 MS+6-BA 0.8 mg/L +NAA 0.2 mg/L;最佳的壮苗生根培养基为1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+苹果汁100 g/L;在文心兰炼苗移栽时宜选择水草作为移栽基质。2.文心兰受体系统的建立及其优化。在文心兰遗传转化研究中,若采用较大颗粒的原球茎为受体易产生嵌合体,不利于后期的鉴定筛选,这就要求对原球茎的生长条件进行优化,以获得适宜遗传转化的细小、颗粒状明显的原球茎受体材料。因此,试验以文心兰试管苗的叶片诱导出的原球茎为材料,比较不同激素配比、基本培养基、pH值、糖类型和糖浓度、光照条件、抗生素对文心兰原球茎生长的影响,并对各因素进行优化,筛选最佳的受体材料生长条件,以建立适于遗传转化的受体系统。试验结果表明,最适宜建立文心兰原球茎受体系统的培养基是1/2 MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L,其最佳培养条件为30.0 g/L白糖为最佳糖源和糖浓度、pH为5.4、琼脂浓度为5.8 g/L、1 500 lx光照强度及20~25℃的培养温度。文心兰原球茎对卡那霉素敏感,25.0 mg/L卡那霉素能够有效地抑制原球茎的生长并使其致死,而50.0 mg/L卡那霉素能够有效地抑制未转化植株的生根,因此,25.0 mg/L卡那霉素和50.0 mg/L卡那霉素分别为文心兰进行遗传转化时原球茎受体系统和小苗生根培养的有效选择压浓度。3.根癌农杆菌介导ACS反义基因导入文心兰转化体系的确立。试验结果表明,稳定转化试验条件为选择固体培养30 d的原球茎,侵染前经过切割去顶端后培养于附加0.25 mol/L甘露醇的高渗固体培养基进行前处理5 h,农杆菌菌液浓度OD600为0.4,农杆菌重悬液白糖浓度为30.0 g/L,农杆菌的侵染时间为35 min,在25℃黑暗条件下于附加2.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的1/2 MS培养基中共培养4 d,共培养培养基pH值为5.4。将上述优化条件进行了30瓶约1 200个文心兰原球茎的遗传转化,GUS瞬时表达检测,在最优转化条件下,文心兰原球茎的GUS瞬时表达率为66.25%。4.文心兰抗性原球茎、抗性植株的筛选及转基因植株移栽。对转化ACS反义基因的原球茎进行抗性筛选及转基因植株再生研究,采用延迟筛选法先对侵染过的原球茎在1/2 MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+ Cef 50.0 mg/L培养基上进行恢复生长30 d,再逐步提高卡那霉素浓度后,置于1/2 MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L + Cef 50.0 mg/L + Km 25.0 mg/L培养基下筛选3个月,选择后的原球茎置于1/2 MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.2 mg/L分化培养基上进行分化培养,将分化的小苗转移到1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+苹果汁100 g/L + Cef 50.0 mg/L + Km 50.0 mg/L筛选壮苗生根培养基中进行生根培养。初步观察转基因植株在生物学性状上与未转基因植株无显著差异,转基因植株移栽2个月后成活。5.文心兰抗性植株的检测。对文心兰抗性再生植株的叶片进行GUS稳定表达检测和ACS反义基因、gus基因的PCR检测。试验共获得了121株由抗性原球茎分化出的小苗,其中23株在卡那霉素抗性筛选中生根,生根的抗性植株经GUS组织化学检测和ACS、gus基因的PCR检测有9株扩增到目的条带,初步证明ACS反义基因和gus基因已整合进文心兰基因组中。总之,本研究建立了文心兰高效再生系统;获得了淡黄色、颗粒状明显的原球茎受体材料,建立了适宜遗传转化的受体系统;首次将ACS反义基因转入文心兰并建立了稳定的遗传转化体系;摸索出了文心兰抗性原球茎的筛选方法和筛选时期;发现在不使用AS时,高浓度糖处理可以提高农杆菌转化文心兰原球茎的转化效率。这为选育花期延长的文心兰新种质,延长文心兰切花的寿命开辟了新途径,为文心兰转基因的研究提供了技术平台。