非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是指不编码蛋白质,以RNA形式发挥生物学作用的一类RNA分子。近年来,非编码RNA作为一类新的调控因子,在原核和真核生物的表达调控中发挥重要的作用。细菌中的非编码RNA称为小RNA(small non-coding RNAs,sRNAs),它们通过碱基配对识别靶标mRNA,调控mRNA的翻译或稳定性,在转录后水平调节基因的表达。sRNAs是细菌适应环境压力、代谢和细菌毒性的重要调节因子。目前,在大肠杆菌中已经发现70多个sRNAs,此外sRNAs还存在于铜绿假单胞菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌、志贺氏菌等细菌中。微小RNA (microRNAs, miRNAs)是一类长度约为20~25 nt的内源性非编码RNA分子,普遍存在于真核生物中。成熟miRNAs可以与靶mRNAs 3′非翻译区互补结合,诱导靶mRNA降解或抑制靶mRNA的翻译,从而实现转录后基因调控作用。miRNAs在细胞增殖、发育、分化以及肿瘤发生中发挥重要的调节作用。幽门螺杆菌( Helicobacter pylori, Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因子,且与胃癌发病密切相关。Hp的一个显著特性是定植在低pH值的胃酸环境中,这需要Hp能够精细调控细菌的基因表达,以适应其生存环境,然而Hp的转录调节能力非常有限,这提示可能存在新的基因调控因素。同时,Hp感染的另一个特性是复杂的免疫反应,虽然机体对于Hp感染能够引发强烈的细胞与体液免疫,但是并不能够有效地清除细菌,感染状态常常持续存在。因此,Hp在与人类长期共存的过程中,相互构成了一个复杂的网络,以精细调控Hp感染的免疫反应,但确切免疫调控机制仍不清楚。目前,关于Hp的非编码小RNA的研究很少,而且miRNAs在Hp感染与免疫中的作用也未见报道。因此,本研究首次通过生物信息学方法和一种基于RNase I保护实验的cDNA文库构建方法,筛选和鉴定出Hp中的非编码小RNA;同时,利用miRNAs芯片、实时定量PCR技术和Northern杂交,筛选出Hp感染引起胃上皮细胞差异表达的miRNAs,并以miR-155为深入研究对象,探讨Hp感染诱导miR-155高表达的分子机制,预测和鉴定miR-155的靶基因,研究miR-155在Hp感染中负向调控炎症反应的作用。本研究以非编码小RNA为切入点,将有助于进一步阐明Hp的基因表达调控网络,同时miRNAs也为深入探讨Hp感染中的免疫调控机制提供了新思路。方法:1. Hp中sRNAs的生物信息学预测与鉴定。首先从Hp 26695基因组序列中,提取大于120 nt的基因间隔区(intergenic region,IGR)序列,然后结合sRNAs的保守性、启动子和终止子分析、二级结构预测,从全基因组水平预测Hp中的sRNAs基因。通过Northern杂交和RT-PCR技术,鉴定侯选的sRNAs基因。2.基于RNase I保护实验原理,构建Hp的自然反义转录子(natural antisense transcripts, NATs)文库。利用双链RNA(dsRNA)能够耐受RNase I的酶切作用的特性。首先提取Hp 26695的总RNA,RNase If酶切去除单链RNA;通过随机引物和逆转录酶的作用生成cDNA;然后在cDNA分子的5′端加上接头(adapter),在3′端加上poly(A)尾,PCR构建NATs的cDNA克隆文库。3. Hp中NATs文库的序列分析及鉴定。对提取的文库质粒进行SmaⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定后,将所有阳性克隆进行测序。测序结果与Hp 26695基因组进行BLAST分析,剔除无关序列和冗长序列后,分析候选NATs的基因组定位,并利用Northern Blot和RT-PCR进行鉴定。4. Hp感染相关miRNAs的筛选与鉴定。以Hp感染细胞模型和Hp感染患者的胃粘膜组织为研究对象,利用miRNAs芯片、real-time PCR和Northern杂交技术,筛选Hp感染引起胃上皮细胞差异表达的miRNAs。5. miR-155在Hp感染中负向调控炎症反应的作用研究。在筛选出的Hp感染相关miRNAs中,我们以miR-155为深入研究的对象,通过启动子分析、荧光素酶实验、信号通路抑制剂实验等方法,探讨Hp感染诱导miR-155高表达的分子机制;结合生物信息学预测、荧光素酶实验、Western blot等方法鉴定miR-155在胃上皮细胞中的靶基因;同时,通过miR-155体外过表达或抑制表达,探讨miR-155负向调控炎症反应的作用及机制。结果:1. Hp中sRNAs的生物信息学预测与鉴定。通过生物信息学预测,在Hp 26695基因组筛选出了6个候选sRNAs,经Northern Blot和RT-PCR鉴定,发现了Hp基因组中的两个新sRNAs,即IG-443和IG-524。基因组定位分析表明,IG-443和IG-524属于自然反义转录子(NATs),分别与相对链上的fliM基因和fumC基因互补,可能以碱基配对的方式调控互补基因的表达。2.基于RNase I保护实验筛选和鉴定Hp中NATs。通过基于RNase I保护实验的文库构建策略,我们成功构建了一个含68个克隆的cDNA文库,经Sma I和Xho I双酶切、测序和BLAST分析后,筛选出了6个能在Hp 26695基因组准确定位的候选NATs;经Northern Blot和poly(A)-tailed RT-PCR鉴定,发现了两个新的Hp NATs (NAT-39和NAT-67)。这两个NATs分别与frpB基因和ceuE基因互补,可能与Hp的铁代谢调节有关。3. Hp感染相关miRNAs的筛选与鉴定。Hp 26695感染胃上皮细胞GES-1 24h后,miRNAs芯片表明,Hp感染引起了一系列的miRNAs的表达改变,如:miR-155、miR-146a、miR-16等的表达上调,miR-181b、miR-324的表达下调。real-time PCR结果与芯片结果一致,表明miR-155, miR-16和miR-146a分别上调了3.0, 2.1和2.5倍。同时,与Hp阴性的正常胃粘膜组织相比,在Hp感染的慢性胃炎病人的胃粘膜组织中,miR-155的表达量也上调了3.9倍(P<0.05)。4. Hp感染诱导miR-155高表达的信号通路。启动子预测表明, miR-155基因的启动子序列中含有NF-κB和AP-1的结合位点。启动子分析、荧光素酶实验、信号通路抑制剂实验表明,NF-κB和AP-1信号通路参与了miR-155的诱导表达,其中AP-1可能在miR-155的诱导表达中起着更为关键的作用。5. miR-155靶基因的预测与鉴定。利用miRNAs靶基因预测软件,筛选出IKK-ε、SMAD2和FADD是miR-155的潜在作用靶点;构建靶基因荧光素酶报告载体和GFP报告载体,证实了miR-155能与靶基因的3′UTR结合;Western blot和real-time PCR结果表明,miR-155可以抑制IKK-ε、SMAD2和FADD靶基因的蛋白表达,而且作用机制各不相同,如直接降解mRNA或抑制蛋白的翻译。6. miR-155抑制Hp感染中炎症因子的表达。体外过表达miR-155后,能够显著减少Hp感染引起的炎症因子(IL-8、GRO-α)的mRNA和蛋白水平(P<0.05),而且这种抑制作用可能是通过降低NF-κB的活性引起的次级效应,这表明miR-155参与了Hp感染中炎症反应的负反馈调节。结论:1.建立了生物信息学预测Hp中sRNAs的方法,且成功筛选出了IG-443和IG-524两个sRNAs,这表明Hp中也存在着sRNAs,它们可能在Hp的基因表达调控中发挥调节作用。2.通过基于RNase I保护实验的文库构建策略,成功构建Hp的NATs文库,且鉴定出两个新的Hp NATs(NAT-39和NAT-67),它们以碱基配对的方式调控互补基因的表达,可能与Hp的铁代谢调节有关。3. Hp感染能够引起胃上皮细胞株和胃粘膜组织中miR-155的表达上调,且miR-155作为一类新的负反馈调节因子,参与了Hp感染中炎症反应的调节过程,这为进一步阐明Hp感染的免疫调控机制及Hp的致病性研究提供新方向。