前言锌是机体必需的微量元素,广泛存在与神经系统中参与许多生物学功能。中枢神经系统中大约85%的锌离子与蛋白质等大分子结合或作为许多酶的辅酶,少部分游离锌离子存在于锌能神经元(zinc-enriched neurons,ZEN)的突触小泡内。采用锌荧光染色技术如zinquin和TSQ荧光染色技术或组织化学技术如Timm染色或金属自显影技术(autometallography,AMG)能够将锌离子准确定位。锌离子不能自由通过细胞膜,特定的转运体和膜通道参与锌离子的跨膜转运和代谢。锌转运体(zinc transporter,ZNT)是参与脑锌代谢的重要蛋白家族之一,目前已知该家族拥有8个成员,即ZNT1-8。ZNT为一组结构和功能相近的蛋白质,均具有六个跨膜区域并且有一个区域含有丰富的组氨酸,为锌离子的结合位点,ZNT的主要功能是将锌离子转运出细胞或聚集在细胞器内,其中ZNT7是一个分子量为42 kDa的膜蛋白,定位于高尔基复合体内,参与锌离子在高尔基复合体内的聚集和含锌蛋白质的加工和组装,是维持神经系统锌稳态的重要ZNT之一。研究表明ZNT7存在于神经系统的大脑和脊髓等,本研究则进一步对ZNT7在小脑和交感神经节的分布和表达进行了详细地研究。海马是产生长时程记忆和短时程记忆的关键脑区,是记忆编码、整理和检索的枢纽。在海马齿状回和CA3区大量的游离锌离子存在于苔藓纤维的突触小泡内。在突触兴奋过程中,锌离子释放到突触间隙内,作为神经调质调节突触后膜受体的功能;同时锌离子还能进入突触后神经元,参与海马学习记忆通路的调节。研究表明锌缺乏能够减少海马锌离子聚集,并引起学习记忆功能的损伤,但到目前为止锌缺乏影响海马学习记忆的具体机制还不十分清楚。海马神经元死亡和再生与突触可塑性的形成密切相关,成年哺乳动物海马齿状回是神经干细胞的重要区域之一,齿状回颗粒细胞下层的神经干细胞能够分化为神经元,新生的神经元移行入颗粒细胞层并发出苔藓纤维参与海马的突触环路的形成,但锌缺乏是否通过影响神经干细胞分化以及促进神经元凋亡导致学习记忆功能损伤还不十分清楚。此外,海马长时程增强(long-term potentiation,LTP)与大脑的学习记忆功能密切相关,大量文献报道细胞内CaM-CaMKⅡ-CREB信号转导通路参与LTP的形成,令人感兴趣的是,目前已经证实在苔藓纤维-CA3的突触通路中,锌能神经元轴突终末释放的内源性锌离子是诱导LTP形成的重要因素,锌缺乏是否通过影响CaM-CaMKⅡ-CREB通路蛋白的表达进而影响学习记忆功能尚未见报道。本研究应用形态学和分子生物学技术,对锌离子和ZNT7在CD-1小鼠神经系统内的定位分布和表达、锌缺乏对海马神经干细胞的增殖分化以及CaM-CaMKⅡ-CREB通路蛋白的影响进行系统分析,为深入探讨锌缺乏导致脑锌代谢紊乱及其影响海马神经元学习记忆功能的机制奠定基础。实验方法选取3周龄CD-1雄性小鼠饲以低锌饲料(锌:0.85mg/kg,AIN-76A,美国Research Diets),建立锌缺乏动物模型,同周龄小鼠饲以适锌饲料作为对照组。应用金属自显影AMG技术检测CD-1小鼠神经系统内游离锌离子的分布;应用免疫组织化学、免疫荧光双标和激光共聚焦扫描显微技术检测ZNT7在CD-1小鼠神经系统内的定位分布及其与锌离子的关系;应用AMG和TSQ荧光染色技术检测锌缺乏CD-1小鼠海马游离锌离子的表达变化;应用免疫组织化学、免疫荧光双标和激光共聚焦扫描显微技术分析锌缺乏小鼠海马神经干细胞的增殖和分化;应用Western blot技术及TUNEL染色对锌缺乏影响神经细胞死亡的机制进行分析;应用Western blot技术分析锌缺乏CD-1小鼠海马学习记忆通路蛋白的表达变化。实验结果1、CD-1小鼠神经系统内ZNT7表达的Western blot分析应用Western blot技术对CD-1小鼠神经系统内ZNT7在蛋白水平的表达进行检测。结果显示,小鼠的大脑皮层、海马和小脑中ZNT7蛋白表达量较高,在脑干、脊髓和颈上神经节中ZNT7表达量较少。2、ZNT7在CD-1小鼠小脑和颈上神经节内的定位分布光镜下观察ZNT7免疫反应位于小脑皮质中。在蒲肯野细胞层,ZNT7免疫反应主要位于蒲肯野细胞的胞体和树突干中,同时在Bergmann胶质细胞的胞体和突起中也有ZNT7的表达。高倍镜下观察ZNT7阳性的Bergmann胶质细胞突起伸入到分子层中。在分子层中只有少数神经元胞体表达ZNT7。在颗粒细胞层,ZNT7免疫反应呈点状分布或半月形分布。应用TGN38作为高尔基复合体标志物,经ZNT7/TGN38免疫荧光双标染色后和共聚焦扫描显微镜观察,发现ZNT7和TGN38共同定位于神经元胞体中,说明ZNT7定位于神经元胞体的高尔基复合体上。大部分SCG神经元表达ZNT7,ZNT7的阳性细胞数占总细胞数的94.53±4.28%。ZNT7的阳性反应位于神经元胞体中,高倍镜下观察,ZNT7呈花瓣状环绕在神经元细胞核的周围。3、游离锌离子在CD-1小鼠小脑和颈上神经节内的定位分布光镜下观察,AMG阳性反应产物呈棕黑色,阳性反应部位代表锌离子的存在。锌离子存在于整个小脑皮层。颈上神经节(superior cervical ganglion,SCG)神经元亚群表达不同程度的AMG阳性反应颗粒;SCG内AMG阳性反应细胞数大约占总细胞数的89.27±8.11%。4、锌缺乏导致生长发育迟缓并降低发育期小鼠海马锌含量锌缺乏组小鼠生长发育缓慢,体重监测结果显示,喂养锌缺乏饲料5周后小鼠体重(17.51±3.98 g)明显低于同龄对照组小鼠体重(31.97±3.66 g)。喂养锌缺乏饲料5周后小鼠的大脑、小脑和海马称重后与同周龄对照组小鼠比较,其重量均低于对照组小鼠。TSQ荧光染色显示,锌缺乏组海马CA3区的荧光染色强度明显低于对照组。AMG染色结果与TSQ荧光染色结果基本一致,海马CA1和CA3区的AMG染色结果显示,锌缺乏组光密度值均低于正常对照组。5、锌缺乏对海马神经干细胞的增殖分化的影响为研究是否锌缺乏影响海马的神经干细胞的增殖分化,我们采用免疫组织化学技术和Western blot技术对新生神经元标记物微管相关蛋白(Doublecortin,DCX)在锌缺乏组和对照组小鼠海马中的表达变化进行分析。免疫染色结果显示DCX阳性细胞主要分布于齿状回颗粒细胞下层。锌缺乏组DCX阳性细胞胞体变小呈不规则行,突起变短分支减少。细胞计数分析结果显示锌缺乏组DCX的阳性细胞总数明显低于对照组DCX阳性细胞数(p＜0.01)。Western blot结果显示,锌缺乏组DCX蛋白条带灰度显著低于对照组(p＜0.01)。应用BrdU免疫染色进一步分析海马神经干细胞的增殖分化。BrdU阳性细胞位于齿状回颗粒细胞下层。细胞计数分析结果显示锌缺乏组BrdU的阳性细胞总数低于对照组BrdU阳性细胞数(p＜0.05)。DCX和BrdU免疫荧光双标共聚焦激光扫描显微镜观察结果显示,在锌缺乏组和对照组小鼠海马齿状回颗粒细胞下层均有DCX/BrdU免疫阳性的神经细胞分布。通过计数免疫双标的阳性细胞总数和统计学分析,发现锌缺乏组神经干细胞总数少于同龄对照组(p＜0.05)。6、锌缺乏通过Fas/FasL和AIF途径诱导海马神经细胞死亡TUNEL染色结果显示,TUNEL阳性反应位于细胞核呈棕黑色颗粒。细胞计数结果显示锌缺乏组海马CA1、CA3和齿状回各区TUNEL阳性细胞数与对照组相比均有显著性增加(p＜0.01)。采用Western blot技术检测锌缺乏组和对照组小鼠海马Fas,FasL,Bax,caspase-3和凋亡诱导因子(Apoptosis Inducing Factor,AIF)的蛋白表达变化。结果表明,Fas和FasL蛋白表达水平在锌缺乏组有明显升高。有活性的caspase-3蛋白水平在锌缺乏组小鼠海马中高于对照组小鼠海马,无活性的caspase-3前体没有显著性变化。此外,锌缺乏能增加凋亡诱导分子AIF蛋白的表达。而Bax的蛋白表达水平在锌缺乏组和对照组之间没有显著性差异。7、锌缺乏影响参与海马学习记忆相关蛋白的表达采用Western blot技术对CaM-CaMKⅡ-CREB信号转导通路蛋白的表达进行研究。结果显示锌缺乏组CaM蛋白水平比对照组减少16.53±5.09%(p＜0.01)。锌缺乏组p-CaMKⅡ蛋白水平也较对照组减少83.47±3.91%(p＜0.01),而总CaMKⅡ蛋白水平在锌缺乏组和对照组无明显区别(p＞0.05)。此外,锌缺乏组p-CREB蛋白表达水平与对照组相比显著性降低(p＜0.01),而总的CREB蛋白水平在2组间无明显差异(p＞0.05)。锌缺乏组海马中,神经颗粒素蛋白表达水平比对照组降低66.11±15.17%(p＜0.05)。然而,通过比较锌缺乏组和对照组的钙调磷酸酶蛋白水平,我们发现2组间无明显差异(p＞0.05)。同时,我们也发现p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平在锌缺乏组海马和对照组海马中无明显区别(p＞0.05)。结论1、CD-1小鼠神经系统中富含ZNT7蛋白,ZNT7参与锌离子在高尔基复合体内的聚集。2、锌缺乏导致生长发育迟缓并降低发育期小鼠海马内锌含量。3、锌缺乏降低海马神经干细胞的增殖分化能力并促进神经元死亡,可能是锌缺乏影响学习记忆能力的原因之一。4、锌缺乏抑制海马CaM-CaMKⅡ-CREB信号转导通路中的主要蛋白表达,可能是影响海马学习记忆能力的另一条途径。