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前言 膀胱移行细胞癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，其显著特点是初发多为浅表性且复发率高，文献报告约有一半以上的患者在术后2年内复发。肿瘤细胞的不断增殖在肿瘤的发生和进展中起重要作用。p53基因的一个主要功能是调节细胞周期，其调节作用是通过其下游靶基因p21WAF1／CIP1实现的，p21WAF1／CIP1又通过与细胞周期素／周期素依赖性激酶结合来调节细胞周期，控制细胞的过度增殖。细胞周期素E（cyclin E）是细胞周期素家族中的重要成员，cyclin E于细胞周期G1晚期／S期表达达高峰，提示cyclin E是调节G1／S期转换的必要蛋白，同时其高表达也是发动DNA复制的先决条件。本研究旨在探讨膀胱癌p53、p21WAF1／CIP1和cyclin E基因的表达及其之间是否存在相互的调节作用，其表达及相互关联能否作为膀胱癌生物学行为的预测指标。 实验材料 一、标本选择 肿瘤实验组：共64例，标本来源于中国医科大学附属第一医院泌尿外科1994～1996三年内膀胱移行细胞癌组织石蜡包埋标本，全部均经病理医师复查证实诊断。男性57例，女性7例。年龄32～85岁（平均61.3岁）。其中经尿道电切肿瘤者40例，膀胱部分切除者17例，行根治性膀胱全切和尿流改道者7例。所有病例均随访24个月。失访或死亡者计为截尾数据。肿瘤细胞分级按WHO标准，Ⅰ级12例，Ⅱ级35例，Ⅲ级17例。临床分期按 UICC1NM标准，浅表性膀航癌门1；乃0例，浸润性膀航癌(Ti－ T．乃4例。正常对照组：5例正常膀眺粘膜取自移植肾供者膀脱组 织。所有标本均常规连续切片，厚度约为 5 pm。 二、主要试剂 购自福州 Maxim Biotech Inc包括：p3鼠抗人单克隆抗体， P21w””‘”‘鼠抗人单克隆抗体，Cyclin E鼠抗人单克隆抗体，Ki67 鼠抗人单克隆抗体。SP试剂盒，DAB显色剂。 实验方 法 二．HE染色：所有切片均作HE染色。 2．采用免疫组织化学SP法进行组织染色。 石蜡切片常规二甲苯脱蜡和酒精水化，高温高压抗原修复。 滴加 A液3％过氧化氢室温10分钟，PBS冲洗三次，每次5分钟， B液 10％正常山羊血清，37℃孵育 20分钟，去血清滴加一抗， 37T孵育2 ／J’时，PBS冲洗三次，每次5分钟。C液生物素标记的 二抗工作液，37℃孵育30分钟。PBS冲洗三次，每次5分钟。D 液链霉菌抗生物素蛋白一过氧化酶溶液，37 T孵育 30分钟。PBS 冲洗三次，每次5分钟。DAB显色。苏木素复染，梯度酒精脱水， 二甲苯透明，中性树胶封片。 3．对照：阳性对照选已订购的阳性对照片，阴性对照用PBS 代替一抗作阴性对照。 4．判定标准：以细胞核内出现棕黄色颗粒作为阳性细胞。 p53o21“’‘’“’‘上yclin E、Ki67阳性染色均定位于细胞核内，偶有 胞浆内同时出现少量棕黄色颗粒。每例切片在光镜下观察 1000 个肿瘤细胞，计算染色细胞所占比例。正常膀眈组织均未发现有 阳性染色。p53、pZI矾’‘儿”‘、Ki67和 cyclin E染色阳性结果分别 为染色细胞数大于5％5％＊％和20％。 ·2· 5．统计学处理：四个指标表达与临床分期、病理分级的关系采用xZ检验。使用SPSS 10．0版统计软件对四个指标间相关性做Spearman检验分析。各指标阳性表达与肿瘤复发的关系采用Ka－planM 分析，用 Log rnk法检测结果是否有显著差异。最后用Cox regression回归分析做影响肿瘤复发的多因素分析。 实验结果 l．p53阳性表达率为43．8％，其阳性与阴性表达在临床分期、病理分级间有差异显著性评＜0．05人 pZI叽”’‘”’阳性表达率为50．0％，其阳性与阴性表达与肿瘤临床分期比较有差异显著性评＜0、01人 cyclin E阳性表达率为 60．9％，在与临床、病理特征的比较中未发现其阳性与阴性表达间存在差异显著性(P＞0．05人 hi67的阳性表达率为 46．9％，其阳性与阴性表达在临床分期、病理分级间比较存在显著性差异河＜0．05，P＜00门。 2．p53、p21”“””‘’‘、cpclin E o KIN间相关性分析 采用 Spe－an相关分析发现好3与 p21”“’““”‘之间存在负相关联系（rs＝－0．630，P＝0．000），P21w“＊“＊‘与 cyclin E之间 未发现有相关性（rs＝－0·160，P＝0．206）。p53、p21”“’“’‘”与 hi67间存在一定相关性，统计值分别为 rs＝0．37，P＝0．003和 Ps＝－0．313，p二0．012。cpclin E与 Ki＊7之间未发现有相关性联系（rs＝＝0．239，P＝0．058）。 3．p53＼pZI”“’“‘”’、cxclin E o hi67表达与膀眈癌患者无瘤生存的关系 应用KaPlan－Meter曲线行单因素分析发现，p53Jyclin E、Ki－67阳性表达组均有较低的无瘤生存率，与各自阴性组比较有