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番茄黄曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）属双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金黄花叶病毒属（Begomovirus），是一类单链环状DNA病毒。该类病毒主要由烟粉虱（Bemisiatabaci）以持久循环型方式传播，可造成包括番茄、烟草在内的多种经济作物的减产甚至绝收，在全球范围内危害严重。
烟粉虱通过刺吸植物韧皮部汁液从感染TYLCV的植株中获取病毒粒子，随后，病毒沿着“口针-中肠-血淋巴-唾液腺”的运输路线在烟粉虱体内进行穿梭，最终随唾液的分泌被传播至植物寄主中。其中，烟粉虱中肠是病毒在烟粉虱体内遇到的首道屏障，病毒穿越介体中肠到达血淋巴的能力与其传播效率密切相关。目前，已知TYLCV可借助网格蛋白介导的胞吞作用突破烟粉虱中肠侵染屏障，即穿过烟粉虱中肠上皮细胞顶端膜进入中肠细胞内；随后，病毒粒子被包裹在囊泡结构中展开胞内运输，经早期内体管状结构到达烟粉虱中肠细胞基底面。对于上述过程，还有许多重要的科学问题需要解答，如究竟由哪些受体参与了病毒的跨膜运输？又有哪些囊泡相关因子参与了病毒的胞内运输？
为探究这两个关键的科学问题，本研究从蛋白-蛋白互作的角度入手，以TYLCV唯一已知的结构蛋白—外壳蛋白（coat protein,CP）为诱饵蛋白，分别利用GSTpull-down结合质谱分析技术、酵母双杂交分离泛素系统，筛选介体昆虫MiddleEast-AsiaMinor1（MEAM1）烟粉虱体内可以与TYLCVCP互作的蛋白，主要发现如下：
（1）烟粉虱受体蛋白BtCUBN与跨膜蛋白BtAMN形成胞吞受体复合物BtCubam帮助TYLCV突破烟粉虱中肠侵染屏障。
将TYLCV CP与GST融合表达作为诱饵蛋白，将保持天然活性的MEAM1烟粉虱胞浆蛋白视为猎物蛋白，经GSTpull-down结合质谱分析鉴定到一个烟粉虱受体蛋白Cubilin（BtCUBN）。BtCUBN不含跨膜区，需要结合烟粉虱跨膜蛋白Amnionless（BtAMN）形成胞吞受体复合物BtCubam发挥功能。
qPCR分析表明，相比于去除中肠外的烟粉虱残体，BtCUBN与BtAMN在烟粉虱中肠内表达量较高。免疫电镜及免疫荧光检测到BtCUBN与BtAMN在烟粉虱中肠细胞微绒毛及细胞质中均有分布。GSTpull-down表明TYLCVCP通过和BtCUBN第12-19CUB结构域互作结合至BtCubam。依据免疫荧光共定位分析结果，推测BtCubam依赖网格蛋白介导的胞吞作用帮助TYLCV完成从烟粉虱中肠腔到中肠细胞内的转移；随后，BtCubam和病毒粒子在早期内体中发生分离；BtCubam最终经循环内体回到细胞膜表面。
除此之外，体内外实验均表明TYLCV CP不能与非媒介昆虫温室白粉虱的CUBN蛋白结合，这可能是导致TYLCV不能突破温室白粉虱中肠侵染屏障的重要原因。
（2）干扰BtCubam可显著降低烟粉虱获取及传播TYLCV的能力。
qPCR、western blot及免疫荧光分析表明，TYLCV侵染能够上调BtCUBN及BtAMN在转录及翻译水平的表达。另外，饲喂CUBN兔单克隆抗体干扰BtCUBN和TYLCV CP之间的互作或注射dsRNA抑制BtAMN的表达，均可抑制烟粉虱对TYLCV的获取及传播。
（3）烟粉虱囊泡膜蛋白相关蛋白VAPB可结合TYLCV CP。
以TYLCV CP为诱饵，以MEAM1烟粉虱cDNA三框表达文库为猎物，经酵母双杂交分离泛素系统筛选得到烟粉虱囊泡膜蛋白相关蛋白（Vesicle-associated membrane protein-associated protein B-like,VAPB）。转录分析表明，相比于除去中肠外的烟粉虱残体，该蛋白编码基因在烟粉虱中肠中具有较高的转录水平。随后，酵母双杂交分离泛素系统验证了VAPB全长可以和TYLCV CP发生互作；GST pull-down的结果表明二者之间的相互作用与VAPB的SCS2结构域相关但与其跨膜区无关。免疫荧光分析显示，VAPB和TYLCVCP在烟粉虱中肠细胞中存在明显的共定位，至于这一结合发生在病毒中肠运输的哪一个阶段尚不清楚。
（4）VAPB负调控烟粉虱对病毒的运输和传播。
TYLCV侵染可以上调VAPB在烟粉虱整虫及中肠中的表达。通过注射dsVAPB发现抑制VAPB的表达反而使得烟粉虱血淋巴和唾液腺中的病毒量显著增加，传毒效率也有所上升。由此，推测VAPB可能负调控病毒从烟粉虱中肠细胞的释放，但这种负调控作用的分子机制尚待探讨。
综上，本研究表明，烟粉虱中肠细胞膜表面受体蛋白BtCUBN与跨膜蛋白BtAMN可形成的胞吞受体复合物BtCubam。TYLCV被烟粉虱取食到达介体中肠腔后，可通过和BtCUBN特定结构结构域的互作结合至BtCubam，随后借助网格蛋白介导的胞吞作用完成从烟粉虱中肠腔到中肠细胞内的运输。这一研究结果初步揭示了TYLCV突破烟粉虱中肠侵染屏障的分子机制，并在此基础上提出了理论模式图。此外，本研究发现了一个可以负调控TYLCV从烟粉虱中肠细胞释放的囊泡膜蛋白相关蛋白VAPB。这些新的发现不仅提升了对“TYLCV突破烟粉虱中肠细胞的运输路径和分子机制”的认知，而且为深入探究“通过干扰TYLCV跨介体中肠细胞的运输来阻断病毒的传播”提供了重要信息。鉴于菜豆金黄花叶病毒属病毒在烟粉虱体内的运输路径相同，本研究的结果对于探究其他菜豆金黄花叶病毒属病毒与媒介昆虫之间的互作关系也具有重要的参考价值。
烟粉虱通过刺吸植物韧皮部汁液从感染TYLCV的植株中获取病毒粒子，随后，病毒沿着“口针-中肠-血淋巴-唾液腺”的运输路线在烟粉虱体内进行穿梭，最终随唾液的分泌被传播至植物寄主中。其中，烟粉虱中肠是病毒在烟粉虱体内遇到的首道屏障，病毒穿越介体中肠到达血淋巴的能力与其传播效率密切相关。目前，已知TYLCV可借助网格蛋白介导的胞吞作用突破烟粉虱中肠侵染屏障，即穿过烟粉虱中肠上皮细胞顶端膜进入中肠细胞内；随后，病毒粒子被包裹在囊泡结构中展开胞内运输，经早期内体管状结构到达烟粉虱中肠细胞基底面。对于上述过程，还有许多重要的科学问题需要解答，如究竟由哪些受体参与了病毒的跨膜运输？又有哪些囊泡相关因子参与了病毒的胞内运输？
为探究这两个关键的科学问题，本研究从蛋白-蛋白互作的角度入手，以TYLCV唯一已知的结构蛋白—外壳蛋白（coat protein,CP）为诱饵蛋白，分别利用GSTpull-down结合质谱分析技术、酵母双杂交分离泛素系统，筛选介体昆虫MiddleEast-AsiaMinor1（MEAM1）烟粉虱体内可以与TYLCVCP互作的蛋白，主要发现如下：
（1）烟粉虱受体蛋白BtCUBN与跨膜蛋白BtAMN形成胞吞受体复合物BtCubam帮助TYLCV突破烟粉虱中肠侵染屏障。
将TYLCV CP与GST融合表达作为诱饵蛋白，将保持天然活性的MEAM1烟粉虱胞浆蛋白视为猎物蛋白，经GSTpull-down结合质谱分析鉴定到一个烟粉虱受体蛋白Cubilin（BtCUBN）。BtCUBN不含跨膜区，需要结合烟粉虱跨膜蛋白Amnionless（BtAMN）形成胞吞受体复合物BtCubam发挥功能。
qPCR分析表明，相比于去除中肠外的烟粉虱残体，BtCUBN与BtAMN在烟粉虱中肠内表达量较高。免疫电镜及免疫荧光检测到BtCUBN与BtAMN在烟粉虱中肠细胞微绒毛及细胞质中均有分布。GSTpull-down表明TYLCVCP通过和BtCUBN第12-19CUB结构域互作结合至BtCubam。依据免疫荧光共定位分析结果，推测BtCubam依赖网格蛋白介导的胞吞作用帮助TYLCV完成从烟粉虱中肠腔到中肠细胞内的转移；随后，BtCubam和病毒粒子在早期内体中发生分离；BtCubam最终经循环内体回到细胞膜表面。
除此之外，体内外实验均表明TYLCV CP不能与非媒介昆虫温室白粉虱的CUBN蛋白结合，这可能是导致TYLCV不能突破温室白粉虱中肠侵染屏障的重要原因。
（2）干扰BtCubam可显著降低烟粉虱获取及传播TYLCV的能力。
qPCR、western blot及免疫荧光分析表明，TYLCV侵染能够上调BtCUBN及BtAMN在转录及翻译水平的表达。另外，饲喂CUBN兔单克隆抗体干扰BtCUBN和TYLCV CP之间的互作或注射dsRNA抑制BtAMN的表达，均可抑制烟粉虱对TYLCV的获取及传播。
（3）烟粉虱囊泡膜蛋白相关蛋白VAPB可结合TYLCV CP。
以TYLCV CP为诱饵，以MEAM1烟粉虱cDNA三框表达文库为猎物，经酵母双杂交分离泛素系统筛选得到烟粉虱囊泡膜蛋白相关蛋白（Vesicle-associated membrane protein-associated protein B-like,VAPB）。转录分析表明，相比于除去中肠外的烟粉虱残体，该蛋白编码基因在烟粉虱中肠中具有较高的转录水平。随后，酵母双杂交分离泛素系统验证了VAPB全长可以和TYLCV CP发生互作；GST pull-down的结果表明二者之间的相互作用与VAPB的SCS2结构域相关但与其跨膜区无关。免疫荧光分析显示，VAPB和TYLCVCP在烟粉虱中肠细胞中存在明显的共定位，至于这一结合发生在病毒中肠运输的哪一个阶段尚不清楚。
（4）VAPB负调控烟粉虱对病毒的运输和传播。
TYLCV侵染可以上调VAPB在烟粉虱整虫及中肠中的表达。通过注射dsVAPB发现抑制VAPB的表达反而使得烟粉虱血淋巴和唾液腺中的病毒量显著增加，传毒效率也有所上升。由此，推测VAPB可能负调控病毒从烟粉虱中肠细胞的释放，但这种负调控作用的分子机制尚待探讨。
综上，本研究表明，烟粉虱中肠细胞膜表面受体蛋白BtCUBN与跨膜蛋白BtAMN可形成的胞吞受体复合物BtCubam。TYLCV被烟粉虱取食到达介体中肠腔后，可通过和BtCUBN特定结构结构域的互作结合至BtCubam，随后借助网格蛋白介导的胞吞作用完成从烟粉虱中肠腔到中肠细胞内的运输。这一研究结果初步揭示了TYLCV突破烟粉虱中肠侵染屏障的分子机制，并在此基础上提出了理论模式图。此外，本研究发现了一个可以负调控TYLCV从烟粉虱中肠细胞释放的囊泡膜蛋白相关蛋白VAPB。这些新的发现不仅提升了对“TYLCV突破烟粉虱中肠细胞的运输路径和分子机制”的认知，而且为深入探究“通过干扰TYLCV跨介体中肠细胞的运输来阻断病毒的传播”提供了重要信息。鉴于菜豆金黄花叶病毒属病毒在烟粉虱体内的运输路径相同，本研究的结果对于探究其他菜豆金黄花叶病毒属病毒与媒介昆虫之间的互作关系也具有重要的参考价值。