口干症(xerostomia)是口腔医学的常见疾病,主要表现为唾液分泌减少引发的口腔干燥。临床上以舍格伦综合征为代表,此外多种致病因素可导致口干症的发生。患者以女性为主,男女发病率比例为1:9,且以更年期妇女为高发人群。舍格伦综合征是一种自身免疫性疾病,表现为淋巴细胞浸润和唾液腺腺管的进行性破坏,但是临床上更多的更年期口干症患者的唾液腺未见显著炎症性改变,其唾液分泌减少的机制不明。实际上,更年期女性体内雌激素分泌急剧下降本身也是一种重要的应激反应,但是,应激反应在唾液腺分泌调节机制中的作用还未见报道。应激反应以下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)的激活为主要特征,表现为体内糖皮质激素的高负荷。研究表明,雌激素分泌减少是反馈性促进HPA激活的途径之一,更年期中HPA的改变是否是口干症发生的关键因素,亟需阐明。除此之外,临床大量口干症的病因未明,长期慢性的应激反应也可能是口干症的一个重要病因,然而,糖皮质激素受体信号通路在唾液腺分泌过程中的调节还未见报道。口腔干燥症与唾液腺水分泌障碍有关;细胞内外的水转运是由水通道蛋白(aquaporins,AQPs)介导的,唾液腺中主要由AQP5介导唾液中水的分泌。本文旨利用AQP5作为唾液腺功能的关键分子靶点,长期应用大量地塞米松模拟体内应激反应时的生理变化,研究应激反应时大鼠颌下腺组织中AQP5表达及甾体类激素受体的改变,揭示应激反应对唾液腺分泌功能的影响和调节其机制,建立甾体类激素受体信号对AQP5基因表达的关联;本研究还筛选了具有AQP5转录激活作用的中药成分,期待应用于舍格伦综合征的治疗。首先,构建地塞米松雌性大鼠应激模型,研究了颌下腺内AQP5的表达及甾体类激素的表达情况。大剂量地塞米松采用肌肉注射的方式作用于雌性大鼠18周,从而构建大鼠构建应激模型。生理指标检测发现,与正常对照组比较,地塞米松应激模型组大鼠饮水量明显增多,而静态唾液流率明显降低。接着,我们研究大鼠颌下腺组织结构。HE染色发现,地塞米松应激模型组大鼠颌下腺腺泡和腺管之间有明显的结缔组织增生。免疫组织化学染色发现,地塞米松应激模型组大鼠颌下腺腺泡细胞中AQP5染色强度显著下降,提示应激反应降低了颌下腺AQP5的表达并引起唾液分泌障碍。我们进一步检测颌下腺中各种甾体类受体的变化,与生理盐水对照组比较,地塞米松应激模型组中颌下腺组织雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)表达显著降低,糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptors,GR)表达显著升高,而雄激素受体(androgen receptor,AR)和雌激素受体β(estrogen receptorβ,ERβ)的表达水平无明显差异。上述结果提示甾体类激素受体与AQP5表达的可能关联。接着,我们从细胞学水平揭示了甾体类激素受体对AQP5转录的调节作用。本课题组重组了从-852bp至+111bP的AQP5启动子序列,并成功构建了AQP5启动子荧光素酶报告基因的细胞模型。我们利用此细胞模型,探讨了四种甾体类激素受体与AQP5的关系。我们发现ERα过表达显著激活AQP5启动子的转录,ERβ对AQP5启动子也有一定程度的激活作用,而GR及AR对AQP5的基因表达无明显影响。然后利用shRNA干涉实验,我们研究了四种甾体类激素受体对AQP5基因转录的必要意义。ERα沉默对AQP5启动子转录的抑制作用最为明显,其次为ERβ,而GR和AR无显著影响。进而,我们利用唾液腺闰管(humansalivary gland,HSG)细胞,研究了四种甾体类激素受体信号对AQP5的蛋白表达水平的影响,发现ERα过表达时增强了糖基化AQP5的蛋白表达水平,并且增强了其蛋白修饰(可能为磷酸化)。以上结果证明,ERα是AQP5调控的关键信号。我们进一步研究了 ERα信号通路和GR信号通路的交叉关联性。在ERα过表达的基础上再次过表达GR,可见,GR可逆转ERα对AQP5表达的活化作用,并呈剂量依赖性,提示了 GR可抑制ERα对AQP5表达的活化作用。动物学和细胞学结果证明,应激反应中GR的升高和ERα的降低都是AQP5表达减少的重要因素,可能共同参与了舍格伦综合征的发病机制。在此基础上,我们在细胞学水平上进行筛选,发现西洋参和黄芪对AQP5的表达具有促进作用。利用AQP5启动子为靶点建立的细胞模型,对200多种中药进行筛选,发现西洋参和黄芪在转录水平明显激活AQP5启动子活性,在蛋白表达水平能明显增大AQP5的蛋白表达量。在此基础上,我们对四种甾体类激素受体分别过表达和沉默,发现西洋参和黄芪主要通过ERα通路对AQP5的转录及蛋白表达产生促进作用。然后,我们以地塞米松应激模型组大鼠为靶点对治疗舍格伦综合征的有效中药进行研究。在给予地塞米松作用的同时,分别对大鼠采取淫羊藿、黄芪、西洋参的灌胃的给药,同时设置地塞米松生理盐水组和正常对照组。首先在生理指标检测上发现,与地塞米松生理盐水组比较,西洋参组和黄芪组的大鼠饮水量减少,静态唾液流率增加,其中以西洋参组对地塞米松的校正作用最为显著,接近正常对照组。而淫羊藿组和地塞米松生理盐水组无明显差异。HE染色发现,地塞米松生理盐水组颌下腺腺泡和腺管间可见显著的结缔组织增生,西洋参和黄芪组大鼠结缔组织增生程度明显降低。AQP5抗体的免疫组化染色发现,与地塞米松生理盐水组比较,西洋参组和黄芪组大鼠颌下腺腺泡细胞中AQP5表达明显升高,说明西洋参和黄芪可提高应激条件下大鼠颌下腺腺泡细胞中AQP5的表达。我们进一步对四种甾体类激素受体染色发现,在西洋参组和黄芪组大鼠颌下腺中ERα表达明显升高,接近正常组。但AR、ERβ、GR的水平无明显变化。上述结果证明,西洋参和黄芪可改善地塞米松应激模型颌下腺中AQP5的表达,且该作用是通过ERα信号通路进行调控。本研究证明:通过大剂量长期应用地塞米松可成功构建引起唾液腺结构和分泌功能改变的动物模型,通过上调GR和下调ERα的表达下调颌下腺AQP5表达。ERα是激活AQP5表达的关键信号,应激反应中GR的过表达可逆转ERα对AQP5表达的激活效应,从而抑制唾液腺分泌并导致口干。在此基础上的中药筛选表明,西洋参和黄芪通过直接上调ERα的表达,纠正了地塞米松/GR信号对AQP5的抑制效应,恢复颌下腺的唾液分泌,可能成为将来临床口干症治疗的重要药物。