研究目的：证明USF2是泛素连接酶Smurf1和Smurf2的负性转录因子,对Smurf1/2在转录水平及蛋白水平上有抑制作用,并对其作用机制进行初步探讨,更进一步研究USF2对Smurf1/2的发挥抑制作用的功能区域。研究方法：一.USF2与其截短体真核表达载体的构建1Myc-USF2与其截短体Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)的构建根据USF2基因序列设计PCR引物,提取细胞总RNA,逆转录后得到cDNA文库。再以cDNA为模板,分别取USF2、USF2(1-235aa)、 USF2(236-346aa)上下游引物,进行PCR扩增得到目的基因片段。扩增产物经电泳分离、回收、酶切后,插入pCMV-Myc的多克隆位点KpnI和SalI之间。连接产物经E.coli DH5α菌株转化后,挑取单克隆并提取质粒,经限制性双酶切鉴定后,阳性克隆送测序测序,测序正确的即为Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)。2.转染真核细胞验证重组质粒的表达各重组质粒转染细胞48小时后,收取细胞,制作蛋白样品,后经由Westernblot验证其在真核细胞中的正确表达。二.USF2对Smurf1、 Smurf2的功能调控研究1Smurf1/2对USF2的调控作用梯度转染Flag-Smurf1或Flag-Smurf2,48小时后,收取并裂解细胞,制作蛋白样品,经Western blot验证其在细胞中对USF2的调控作用。内源性免疫共沉淀(Co-IP)实验验证Smurfs和USF2是否存在相互作用,实验组使用USF2抗体进行IP,对照组使用小鼠Normal IgG抗体,Smurf1抗体和Smurf2抗体检测IP样品,以此判断USF2与Smurf1或Smurf2之间有无相互作用。2.USF2抑制Smurf1/2的转录表达梯度过表达Myc-USF2, Western blot检测Smurf1/2的蛋白水平的变化,再利用实时定量PCR技术检测Smurf1/2的mRNA水平,检测USF2对Smurf1/2蛋白及转录水平的影响。为了进一步验证USF2对Smurf1/2的调节作用,细胞中依次转染USF2siRNA及Control siRNA,敲低细胞内源USF2,再分别利用Western blot和实时定量PCR技术检测Smurf1/2蛋白水平和转录水平的变化。利用生物信息学段分析Smurf1/2的启动子区是否含有E-box结构域,之后构建了含有Smurf1/2promoter区E-box结构域的PGL3-enhance报告基因载体,通过双荧光素酶报告基因实验来验证USF2对Smurf1/2启动子活性的抑制作用。3.USF2结合Smurf1/2启动子区本实验设计体内、体外实验,来确认USF2可以结合Smurf1/2启动子区,进一步证实USF2是Smurf1/2的转录抑制因子。首先设计引物,进行体内染色质免疫沉淀(ChIP)实验,从而证实在体内USF2可以结合Smurf1/2启动子区。为了确证USF2在体外可以直接结合Smurf1/2启动子区,我们首先纯化GST-USF2蛋白,并验证其正确表达,然后制作包含Smurf1/2E-box结构域的生物素标记探针,进行体外凝胶迁移(EMSA)实验。其中,为了进一步确认结果的可靠性和确认USF2和Smurf1/2promoter区结合的特异性,我们设计了冷探针竞争实验,即使用不同高浓度的未标记生物素的冷探针和突变冷探针,竞争生物素探针与USF2蛋白的结合。另外我们使用USF2抗体,进行超阻滞实验,以排除其他基因或非特异性蛋白带来的影响。三.USF2对Smur1/2发挥抑制效应功能区的研究将Myc-USF2、Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)转染到MCF7细胞中,48h后收集并裂解细胞,通过Western blot及实时定量PCR确定USF2抑制Smurf1/2转录水平的具体功能区域。研究结果：一.USF2与其截短体真核表达载体的构建1.成功构建重组质粒Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)。挑取阳性克隆,提取质粒后进行双酶切鉴定,将酶切阳性结果送测序,测序正确的重组质粒说明Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)构建成功。2.转染真核细胞重组质粒的正确表达将构建正确的重组质粒转染细胞,经Western blot验证其在真核细胞中能够正确表达。二.USF2对Smurfl1、Smurf2的功能调控研究1Smurf1/2对USF2无调控作用梯度转染Flag-Smurf1或Flag-Smurf2,由Western blot验证,发现USF2蛋白水平不随着Smurf1/2的变化而变化,初步认为USF2不是Smurf1/2的泛素化底物。而后进行的内源性Co-IP实验证明,和使用Normal IgG抗体的对照组一样,使用USF2抗体进行IP的实验组没有检测到Smurf1或Smurf2,说明USF2与Smurfs之间无相互作用。2.USF2对Smurf1/2转录有抑制作用梯度转染Myc-USF2, Western blot检测后发现Smurf1/2的蛋白水平呈现梯度下降,实时定量PCR检测发现Smurf1/2的mRNA水平也下降,说明USF2对Smurfs的蛋白水平和mRNA水平均有抑制作用。敲低细胞内源USF2后则得到相反的效应。为了确证USF2对Smurfs是在转录水平还是转录后水平发挥抑制作用,我们构建了含有Smurf1/2promoter区E-box结构域的PGL3-enhance报告基因,发现过表达USF2对Smurf1/2转录活性具有明显的抑制作用,敲低反之。双荧光素酶报告基因实验证实USF2对Smurf1/2是在转录水平发挥了抑制作用而最终导致其大蛋白水平的降低。3.USF2结合Smurf1/2启动子区ChIP实验明确USF2在体内可以结合Smurf1/2的启动子,证实USF2是Smurf1/2的转录因子。纯化GST-USF2蛋白,Western blot并验证其正确表达。进行体外EMSA实验,结果得到USF2和Smurf12promoter区结合能够产生DNA-蛋白复合体,即说明USF2在体外可以直接结合Smurf1/2的启动子。使用不同高浓度的冷探针,可以成功竞争生物素探针与USF2蛋白的结合；而使用突变探针后,DNA-蛋白复合体结合条带消失,从而进一步确证USF2特异的结合Smurf1/2的启动子。另外,使用USF2抗体进行EMSA超阻滞实,发现结合条带迁移明显滞后。以上说明USF2特异性结合Smurf1/2启动子区。三.USF2对Smur1/2发挥抑制效应功能区的研究转染Myc-USF2、Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)48h后,Western blot及实时定量PCR,发现Myc-USF2、Myc-USF2(236-346aa)对Smurf1/2的蛋白及转录水平有抑制作用,而Myc-USF2(1-235aa)不具备抑制效应,说明对Smurf1/2发挥转录抑制的功能区域主要是USF2的第236到第346氨基酸之间的区域。结论及意义：本研究首次发现了Smurf1和Smurf2的负性转录因子——USF2,它可以抑制Smurf1/2的转录水平,从而降低其蛋白的表达,同时证明了USF2对Smurf1/2的负性调节作用主要是通过USF2端第236到346氨基酸之间的区域发挥的。这为进一步研究Smurf1/2分子的转录调控机制,及USF2生理功能的深入探讨奠定了基础。