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光学分子影像学对于病毒的标记研究有着重要的意义。在流感病毒研究领域,标记病毒的研究一直层出不穷,对于流感病毒致病机理和感染规律的研究有着巨大的推动作用。对于一些传染性强、致死率高的流感病毒来说,假病毒的构建消除了其存在的安全隐患,以其优良的安全性和稳定性为病毒致病机理的研究和疫苗的研发提供了有效的技术手段。在生物学研究领域最常用的分子影像学方法是荧光分子成像(Fluorescence)和生物发光成像(Bioluminescence)两大类。荧光分子成像技术和生物发光成像技术它们都有各自的优缺点:生物发光无自发荧光,特异性强,灵敏度高,能够精确定量,但信号较弱,检测时间较长,要求高,实验成本高;荧光分子成像信号强度高,成像速度快,实验成本低,能够保持研究的连贯性,但检测深度受限制,较难精确体内定量。本实验选用了其中的绿色荧光蛋白Green fluorescent protein(GFP)和Gaussia荧光素酶Gaussia luciferase(Gluc)同时用于分子成像,综合了两者优势的同时弥补了彼此的不足。H5N1禽流感属高致病性流感病毒,传播快,病死率高。对于高致病性的病毒进行实验研究需要在高等级的生物安全实验室进行,增加了实验的成本和难度,H5N1假病毒的构建克服了其生物安全问题,在低等级的生物安全实验室即可完成相关病毒实验。本实验H5N1假病毒的构建为H5N1病毒致病性的研究和抗病毒药物研制及筛选提供了一种安全有效的技术手段。本课题根据文献报道合成split-GFP基因,分别构建含G1-10与G11的pcDNA3.1表达质粒并通过荧光观察验证其相互作用。然后通过融合PCR技术将Gluc基因与G11基因通过Linker连接并插入到pcDNA3.1上,与G1-10表达质粒共转染293T细胞,测定细胞上清中Gluc荧光素酶的活性,并进行GFP荧光观察。为了更方便对病毒进行细胞水平的观测和筛选,利用慢病毒表达系统构建能稳定表达G1-10的MDCK细胞系,再向细胞系中转染G11质粒,通过RFP标记和嘌呤霉素的抗性对细胞系以及GFP活性进行筛选与验证。实验结果表明Gluc-G11与G1-10质粒共转染后,细胞能够发出明亮的绿色荧光,上清中荧光素的活性也较高。在此基础上,建立的G1-10 MDCK细胞系能够稳定表达出G1-10,用G11质粒转染该细胞系后,可检测到GFP荧光。本课题成功构建的含Gluc-GFP的双标记系统,为在细胞和活体水平研究病毒致病机制提供了技术手段。本课题应用构建好的含H5N1流感病毒的HA片段的pcDNA3.1-HA质粒与HIV骨架质粒pNL4-3.Luc.RE共转染293T细胞,72h后收集病毒上清,测定细胞上清中的荧光素酶活性,然后用PEG-it纯化病毒上清,利用纯化后的病毒与H5N1-HA抗体进行ELISA实验。结果显示细胞上清中含有荧光素酶的表达,在纯化后的病毒ELISA实验中可以检测到HA的存在,初步确定H5N1-HA假病毒构建成功。