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研究背景卒中后中枢痛(Central post stroke pain,CPSP)是一类与卒中病灶直接相关的慢性神经病理性痛,常呈持续或间断性出现。由于CPSP产生的疼痛剧烈,疼痛性质难以描述,且临床医师对CPSP认识较少,使患者长期处于疼痛状态,进而产生的焦虑、抑郁样情绪变化又加剧了患者的疼痛,形成恶性循环。据报道全球约1～14%的卒中患者在发病数月内出现CPSP,丘脑出血是CPSP产生的主要原因。丘脑出血后患者出现疼痛、情绪异常及学习记忆障碍等症状,严重影响患者的生活质量和社会功能。因此研究CPSP的发病机制对改善丘脑出血患者的预后尤为重要。丘脑出血后除了原发性出血灶,继发性损伤在CPSP的产生和发展中发挥重要作用。神经炎症作为继发性损伤的重要部分,诱导胶质细胞过度激活和神经元损伤,导致神经病理性痛产生。小胶质细胞是脑内的巨噬细胞,为中枢神经系统固有的免疫效应细胞,可作为神经损伤的第一反应者,在中枢神经系统的生理过程中发挥着极其重要的作用。既往的研究发现在中枢神经病理性痛模型中除了小胶质细胞的生理学和形态学变化外,细胞表面多种受体激活及其释放的炎症因子等均可参与疼痛的产生。抑制小胶质细胞及细胞内信号传导途径的激活可减缓神经病理性痛产生。综上所述,小胶质细胞过度活化可能导致CPSP产生。因此本研究将特异性剔除小胶质细胞,观察剔除小胶质细胞能否缓解疼痛状态,进一步明确小胶质细胞在CPSP发生发展中的作用。小胶质细胞的存活依赖于集落刺激因子1受体(Colony stimulating factor 1 receptor,CSF1R)信号传导,集落刺激因子1是参与小胶质细胞募集和激活的关键细胞因子,抑制CSF1R可迅速剔除中枢神经系统中的小胶质细胞。培西达替尼(Pexidartinib3397,PLX3397)是一种有效的CSF1R抑制剂,可以自由穿过血脑屏障,与高亲和力CSF1R结合竞争性抑制脑内小胶质细胞的募集和激活。研究发现持续21天使用PLX3397可剔除脑内90%的小胶质细胞且不影响脑内其他固有细胞的表达,包括神经元,星形胶质细胞或少突胶质细胞。因此本研究选择PLX3397这一小胶质细胞抑制剂,验证小胶质细胞在CPSP产生中的作用。Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)是一种关键的先天免疫受体,在中枢神经系统主要在小胶质细胞表达,可作为激活小胶质细胞的分子靶标。据报道,氧化应激可上调人巨噬细胞中TLR4的表达并激活核转录因子kB(Nuclear factor kB,NF-kB)信号传导途径,从而刺激下游炎症因子的释放。此外,TLR4也可参与先天性和适应性免疫反应以及慢性疼痛和神经病理性痛的诱导、转化和维持。既往研究发现与野生型小鼠相比,TLR4基因敲除(Knock out,KO/TLR4-/-)鼠可抑制脑出血引起的脑损伤,减轻脑水肿及神经功能损伤,减少细胞凋亡。然而CPSP模型中TLR4是否介导小胶质细胞的激活引起CPSP产生尚未见报道。为了验证TLR4是否通过参与介导小胶质细胞的激活引起CPSP产生,本研究选择TLR4-/-鼠建模观察小胶质细胞激活情况及痛阈变化,进一步研究TLR4参与CPSP产生的分子机制。本文通过对CPSP的发病机制进行研究,发现小胶细胞参与CPSP产生的分子靶点,为临床卒中后中枢痛的治疗研究提供一定的理论基础和实验依据。研究目的(1)建立小鼠丘脑出血CPSP模型,检测痛阈等相关行为学变化,观察血肿周围髓鞘、死亡神经元和胶质细胞激活等形态学变化,研究小胶质细胞及其表面受体TLR4的激活是否介导神经炎症产生。(2)通过使用PLX3397剔除CPSP模型小鼠脑内的小胶质细胞,检测术后机械痛、冷痛、小胶质细胞激活量和TLR4信号通路蛋白表达量等的变化,研究小胶质细胞是否通过TLR4信号通路激活介导神经炎症,参与CPSP的发生发展。(3)使用TLR4-/-鼠建模后,痛阈和免疫荧光检测验证TLR4蛋白参与小胶质细胞的过度活化,诱发CPSP。研究方法(1)建立小鼠丘脑出血模型检测术后病理学变化,行为学评估CPSP模型是否成功建立将小鼠分为Sham组和CPSP组。立体定位注射Ⅶ型胶原酶建立小鼠丘脑出血模型。建模后D1新鲜脑切片检测血肿位置和体积,建模后D3采用CV/LFB(Crystal violet staining solution/Fast blue)双染色法检测血肿周围髓鞘的数量变化,FJB(Fluoro-jade B)染色检测血肿周围死亡神经元数量改变。建模后不同时间点进行行为学检测包括运动功能检测(神经功能评分和转角实验),痛阈检测(机械痛、冷痛),焦虑抑郁样情绪检测(旷场、高架十字迷宫、强迫游泳和悬尾)和学习记忆检测(Y-迷宫、新物体识别),评估CPSP模型建立成功。(2)探讨CPSP的发病机制丘脑出血后D3,免疫荧光染色检测血肿周围小胶质细胞和星形胶质细胞激活等神经炎症改变及TLR4蛋白的定位。(3)明确小胶质细胞参与脑出血后CPSP的发生发展建模前D21,选取正常的C57BL/6J小鼠通过口腔灌胃的方式给予PLX3397(浓度:10mg/mL,每只小鼠剂量:40mg/kg),每天一次,直至术后取材。将小鼠随机分为两组:CPSP+Vehicle组,CPSP+PLX3397组。术后D0、D1、D3、D5和D7分别检测小鼠痛阈改变,术后D3检测血肿大小,血肿周围髓鞘,死亡神经元数量和胶质细胞激活等变化,术后D7 WB检测TLR4/MyD88信号通路蛋白表达量变化。(4)解析小胶质细胞参与神经炎症诱导CPSP发生的信号通路采用TLR4-/-鼠进行建模。将实验动物分为三组:WTSham组,WTCPSP组,KOCPSP组。丘脑出血术后D0、D1、D3、D5和D7检测机械痛冷痛痛阈变化,术后D3形态学染色检测血肿周围胶质细胞激活情况。研究结果(1)丘脑出血后D1血肿出现,术后D3血肿周围髓鞘数量减少,死亡神经元数量增多。丘脑出血后小鼠无运动功能损伤,但术后D1小鼠冷痛痛阈降低并持续至D14,术后D3机械痛阈降低持续至D14(p<0.05),CPSP术后D14小鼠也可出现焦虑抑郁和学习记忆功能障碍(p<0.05),提示CPSP建模成功。(2)CPSP建模后D3,血肿周围小胶质细胞和星形胶质细胞大量激活(p<0.05),TLR4蛋白主要表达于小胶质细胞表面。(3)使用小胶质细胞抑制剂PLX3397后D1冷痛痛阈明显减轻,D3机械痛痛阈即出现显著改善(p<0.05);血肿周围髓鞘数量增多,死亡神经元及小胶质细胞激活数量显著减少(p<0.05);TLR4/MyD88信号通路蛋白表达量显著降低(p<0.05)。(4)使用TLR4-/-鼠建模后,小鼠机械痛、冷痛明显缓解(p<0.05),胶质细胞激活数量显著减少(p<0.05)。研究结论(1)胶原酶注射建立丘脑出血模型后,小胶质细胞过度激活产生神经炎症促发CPSP。(2)小胶质细胞表面TLR4及其下游信号通路激活介导CPSP的发生发展过程。