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目的: 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节组织慢性炎症、骨及软骨破坏为主要表现的全身性自身免疫性疾病。近年来研究发现miRNAs(microRNAs)与RA的发生发展密切相关,循环miRNAs(circulating miRNAs)作为RA诊断标记物具有重要的潜在价值。本课题组前期在RA患者血浆中筛选得到9种差异性表达的miRNAs,本文进一步检测这些差异性表达的miRNAs在胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠血浆中变化并探讨血浆miRNAs的可能来源,从而为研究循环miRNAs在RA发病过程中的作用提供理论依据。 方法: (1)使用牛Ⅱ型胶原和佐剂免疫DBA/1J小鼠建立CIA模型,采用实时荧光定量PCR(quantitative Real-time fluorescent PCR,qRT-PCR)检测CIA小鼠及正常对照小鼠血浆和外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中miR-9、miR-122-3p、miR-181d及miR-342-3p的表达水平。 (2)分离CIA及正常小鼠PBMC,分别采用100 ng/ml LPS及2.5μg/ml PHA体外刺激培养1h和2h。应用qRT-PCR检测培养细胞和上清中miR-9、miR-122-3p、miR-181d及miR-342-3p的表达水平。 (3)采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)分选CIA及正常对照小鼠外周血、脾脏、淋巴结CD4+T、CD8+T细胞,采用实时荧光定量PCR检测CD4+T、CD8+T细胞中miR-9、miR-122-3p、miR-181d及miR-342-3p的表达水平。 结果: (1)与正常DBA/1J小鼠相比,CIA小鼠血浆miR-9、miR-122-3p、miR-181d及miR-342-3p的表达水平均显著增高(P均<0.05)。 (2)CIA小鼠PBMC中miR-181d表达水平高于正常对照小鼠(P<0.05),但miR-9、miR-122-3p及miR-342-3p的表达水平二者无统计学差异(P均>0.05)。 (3)与相应空白对照组相比,LPS刺激后的小鼠PBMC及培养上清中miR-9、 miR-122-3p、miR-181d及miR-342-3p的表达水平未见明显改变(P均>0.05)。PHA刺激虽未改变小鼠PBMC和培养上清中miR-9、miR-122-3p及miR-342-3p的表达水平(P均>0.05),但能显著上调培养细胞和上清中miR-181d表达水平,且PHA刺激的CIA小鼠PBMC和培养上清中miR-181d的表达水平明显高于相应刺激的正常对照小鼠(P<0.05)。 (4)与正常对照相比,CIA小鼠外周血CD4+T细胞中miR-181d的表达水平无明显差异(P>0.05),外周血CD8+T细胞中miR-181d的表达水平虽有升高趋势,但无统计学差异(P=0.07);CIA外周血CD4+T、CD8+T细胞中miR-9、miR-122-3p、及miR-342-3p的表达水平均无明显差异(P>0.05)。 (5)CIA淋巴结CD4+T、CD8+T细胞中miR-181d的表达水平与正常相比无明显差异(P>0.05),但CD4+T细胞中miR-342-3p的表达升高,而miR-9及miR-122-3p的表达水平降低(P均<0.05);CD8+T细胞中miR-122-3p的表达水平也降低(P<0.05)。 (6)与正常对照相比,CIA小鼠脾脏CD4+T、CD8+T细胞中miR-9、miR-122-3p、miR-181d及miR-342-3p的表达水平均无明显差异(P均>0.05)。 结论: 1、从RA患者外周血中筛选得到的四种差异性表达的miRNAs在关节炎小鼠模型中也发生特征性改变,但二者结果不完全一致。 2、miR-181d在CIA小鼠血浆、PBMC以及体外PHA刺激后的表达均显著增高,提示miR-181d可能在CIA小鼠发病过程中发挥重要作用。 3、CIA小鼠淋巴结CD4+T、CD8+T细胞中miR-9、miR-122-3p及miR-342-3p的表达亦发生明显改变,进一步探讨其潜在的作用可为RA发病机制研究提供新的思路。