肝癌是广西高发的一种地域性肿瘤，在临床上，由于肿瘤的多药耐药导致化疗失败的现象普遍存在。ABC(ATP-binding cassette)跨膜转运蛋白超家族在肿瘤多药耐药中具有重要意义，尤其是其家族成员ABCB1、ABCC1及ABCG2是在耐药中被广泛研究且发挥重要作用的蛋白。　　近年来，表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)，茶叶中活性最高的一种儿茶素，经研究发现不但具有抑制肿瘤、抗氧化、抑制血管生成等药理作用，还具有逆转肝癌多药耐药作用。本研究主要致力于深入开展Y6体内及体外逆转多药耐药的作用研究，与ABC跨膜转运蛋白相关的作用机制，以及对丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通道调控作用的影响。　　目的:　　1.研究Y6是否对ABCB1介导的细胞多药耐药的具有逆转作用，探究其耐药逆转的机制。　　2.研究Y6是否对ABCG2介导的细胞多药耐药的具有逆转作用，探究其耐药逆转的机制。　　3.研究Y6在逆转细胞多药耐药过程中是否对MAPK信号通路产生影响，探究各通路的磷酸化蛋白与耐药之间的关系。　　4.采用人肝癌细胞BEL-7404和BEL-7404/DOX，建立裸鼠的人肿瘤异种移植瘤模型，探讨Y6体内抑瘤的效果。　　方法:　　1.(1)建立不同的细胞株:经阿霉素(doxorubicin，DOX)诱导的肝癌耐药细胞株BEL-7404/DOX及其亲本细胞株BEL-7404;经人胚肾HEK293细胞转染得到的HEK293/pcDNA3.1和ABCB1过表达的细胞株HEK/ABCB1。　　(2)MTT法测定Y6在两对细胞中的毒性，以及Y6对耐药细胞株的耐药倍数的影响。确定逆转效果后选择肝癌耐药细胞株进行以下实验。　　(3)Annexin-Ⅴ-FITC/PI染色法测定Y6联合阿霉素对细胞凋亡的影响。　　(4)实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法测定Y6在耐药逆转过程中对hif-1α及ABCB1基因的影响。　　(5)蛋白免疫印迹(Western blot，WB)法检测Y6在耐药逆转过程中对缺氧诱导因子1α（Hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α）及ABCB1蛋白表达的影响。　　(6)使用HIF-1α特异性抑制剂Oligomycin抑制HIF-1α表达后，WB法检测Y6在耐药逆转过程中对ABCB1蛋白表达的影响。　　(7)ATPase试剂盒测定Y6对ABCB1蛋白的ATPase活性的影响。　　(8)分子对接实验检测Y6与ABCB1蛋白的亲和力。　　2.(1)建立不同的细胞株:经米托蒽醌诱导人非小细胞肺癌耐药细胞株NCI-H460/MX20及其亲本细胞株NCI-H460;经人胚肾HEK293细胞转染得到的HEK293/pcDNA3.1和ABCG2过表达的细胞株HEK/ABCG2-482-R2。　　(2)MTT法测定Y6在两对细胞中的毒性，以及Y6对耐药细胞株的耐药倍数的影响。确定逆转效果后，选择米托蒽醌诱导的耐药株NCI-H460/MX20及其亲本细胞株NCI-H460进行以下实验。　　(3)WB法检测Y6在耐药逆转过程中不同作用时间或不同作用浓度对耐药细胞中ABCG2蛋白表达的影响。　　(4)免疫荧光(immumofluorescence，IF)法检测Y6在耐药逆转过程中对ABCG2亚细胞定位的影响。　　(5)对NCI-H460和NCI-H460/MX20细胞使用放射性氚标记的米托蒽醌[3H]-Mitoxantrone处理后进行accumulation assay，检测Y6对细胞内的米托蒽醌累积浓度的影响。　　3.WB法检测Y6在逆转人肝癌耐药细胞BEL-7404/DOX过程中，对MAPK的3条信号通道:细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulatedkinase，ERK)通道，应激激活蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）通道，又叫c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通道及p38通道中的磷酸化蛋白p-ERK1/2、p-JNK以及p-p38表达的影响。　　4.建立BEL-7404（8只裸鼠）和BEL-7404/DOX(48只裸鼠)细胞的异种移植瘤模型以探讨Y6体内的抑瘤作用。接种BEL-7404/DOX细胞的裸小鼠随机分组，每组8只，分为对照组、DOX组（单用阿霉素）、Y6组（单用Y6）、DE组（80mg/kg EGCG联合DOX）、DYL组(110mg/kg Y6联合DOX)、DYH组(220mg/kg Y6联合DOX)。实验开始前及结束剥瘤后称量小鼠体重，隔日测量瘤体大小，观察肿瘤的生长情况至给药20天结束。颈椎脱臼处死裸鼠，取瘤组织，称瘤块重量，计算抑瘤率，绘制肿瘤生长曲线。　　结果:　　1.(1)Y6在分别小于15μM和3μM的浓度下对肝癌细胞株和人胚肾细胞株无明显毒性。Y6在浓度为10μM和15μM时分别联合阿霉素使用，可以将BEL-7404/DOX的耐药倍数从29.2倍分别降至3.8和2.9倍;在浓度为1μM和2μM时分别联合阿霉素，可以将HEK/AB CB1细胞的耐药倍数从25.9降至3.0和1.8。在使用相同剂量的情况下，Y6对耐药细胞的逆转效果较EGCG好。　　(2)单用阿霉素组的细胞晚期凋亡率为12.17％，联合10μM EGCG或10μM Y6或15μMY6后细胞的晚期凋亡分别增加至19.52％、27.89％和40.03％。分别与单用阿霉素组相比，其差异均有统计学意义(*p＜0.05)。而且相同剂量的Y6比EGCG可以诱导更多的细胞凋亡，两组之间差异有统计学意义（＃p＜0.05）。　　(3)单用阿霉素组的细胞hif-1α基因表达量为0.90，联合10μM EGCG或10μMY6或15μMY6后细胞的hif-1α基因表达量分别减少至0.49、0.19和0.10。分别与单用阿霉素组相比，其差异均有统计学意义(*p＜0.05)。另外，单用阿霉素组的细胞ABCB1基因表达量为0.71，联合10μM EGCG或10μM Y6或15μM Y6后细胞的ABCB1基因表达量分别减少至0.39、0.25和0.19。分别与单用阿霉素组相比，其差异均有统计学意义（&p＜0.05）。　　2.(1)Y6在小于15μM的浓度下对两对细胞株无明显毒性。5μM或10μMY6分别联合米托蒽醌、SN-38或拓扑替康(topotecan)使用，均可以明显降低耐药株NCI-H460/MX20和HEK/ABCG2-482-R2对上述抗肿瘤药物的耐药倍数，且差异有统计学意义（*p＜0.05）。　　(2)对NCI-H460/MX20耐药细胞给予10μM Y6不同的时间0h，24h，48h，72h处理，或Y6不同浓度5，10，15μMY6均72h处理后，WB法发现细胞ABCG2表达水平无明显改变（*p＞0.05）。　　(3)对NCI-H460/MX20细胞采用10μM Y6作用不同时间0h，24h，48h，72h处理后，与对照组（0h处理组）比较，IF法发现各组细胞ABCG2蛋白的亚细胞定位无明显改变。　　(4)NCI-H460/MX20细胞经5、10μM Y6处理后细胞内[3H]-Mitoxantrone累积量分别与control组比较，其差异均具有统计学意义（*p＜0.05）。且其累积量随着Y6浓度的增加而增加。。　　结论:　　1.(1)Y6在体外不仅可以提高ABCB1高表达的耐药细胞对阿霉素的敏感性，逆转细胞耐药，并且可以明显诱导耐药细胞的凋亡，效果均比EGCG好。(2)Y6不仅可以通过下调HIF-1α表达来抑制ABCB1的蛋白表达，也可以直接抑制ABCB1蛋白表达来实现耐药逆转。(3)Y6可以作为一个典型的竞争性底物与药物竞争ABCB1转运蛋白上的药物结合位点，同时激活ATP水解供能。从而抑制了阿霉素的外排，增加细胞内阿霉素浓度而达到逆转耐药的目的。　　2.(1)Y6在体外可以明显提高ABCG2高表达的细胞对抗肿瘤药物的敏感性，逆转细胞耐药。(2)Y6逆转细胞耐药不是通过下调ABCG2转运蛋白的表达或者改变ABCG2蛋白的亚细胞定位来实现的。(3)Y6可以增加细胞内米托蒽醌的蓄积，减少米托蒽醌排出。其机制可能与Y6作为一个典型的竞争性底物，结合到ABCG2蛋白的药物结合位点上，同时激活ATP酶活性有关。　　3.Y6通过上调p-ERK1/2、p-JNK以及p-p38的蛋白表达水平激活了3条平行的MAPK信号通路，在耐药逆转过程中发挥了重要作用。　　4.Y6在体内对肿瘤多药耐药的也有逆转作用，且逆转效果较EGCG好。