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研究背景与目的：
HER2/ErbB2作为EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor，表皮生长因子受体)家族成员之一，在大约20%~30%的乳腺癌中呈阳性表达，且与乳腺癌发生发展及预后不良相关。赫赛汀(Herceptin)是靶向HER2抗体药物，常用于HER2阳性型乳腺癌的治疗，但是临床上只有不超过35%的HER2阳性型乳腺癌患者对Herceptin治疗敏感，且这些敏感患者在治疗过程中也易形成继发性耐受。因此，阐明HER2阳性型乳腺癌对Herceptin治疗耐受的机制具有十分重要的意义。
研究提示，IGF-1R信号活化与乳腺癌细胞Herceptin耐受相关，本课题组前期研究亦发现IGF-1R可与HER2和HER3形成异源三聚体介导乳腺癌细胞Herceptin耐受，同时发现Herceptin耐受细胞培养液中IGF2蛋白含量升高，耐受细胞中IRS1蛋白表达上调。胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor-2 ， IGF2)可通过与细胞表面特定的受体IGF-1R(insulin-like growth factor-1 receptor)结合激活细胞内各种信号通路而在个体生长发育和肿瘤形成中起重要作用；IGF-1R作为酪氨酸激酶生长因子受体，与其配体IGF2结合后，通过IRS1(subsequently phosphorylates insulin receptor substrate 1)激活下游效应信号通路，抑制细胞凋亡、促进细胞周期进展和血管生成等生物学进程。本研究将以HER2阳性型乳腺癌亲代细胞SKBR3和BT474及其对应的Herceptin耐药细胞SKBR3/pool2和BT474/HR20为模型，进一步探究IGF2/IGF-1R/IRS1信号通路在HER2阳性型乳腺癌Herceptin治疗耐受中的作用及其异常活化的分子机制。
研究方法：
1.采用HER2阳性型乳腺癌亲本细胞SKBR3和BT474及其衍生的Herceptin耐受细胞SKBR3/pool2和BT474/HR20为模型，体外细胞实验结合体内动物实验验证各细胞对Herceptin的敏感性，通过qRT-PCR、ELISA、westernblot实验检测相关基因的表达以及它们的磷酸化水平；
2.通过MTS检测经相关抑制剂处理或干扰IRS1后细胞的药物敏感性，以及用IGF2处理和过表达IRS1后细胞的药物敏感性；
3.通过生物信息学分析miRNAs可能与IRS1和IGF2mRNA的3-UTR结合，qRT-PCR验证miRNAs在耐药细胞中的表达，westernblot、ELISA、报告基因试验检测miRNAs对IRS1和IGF2的调控作用；
4.MTS检测过表达IRS1或过表达miRNAs后细胞的药物敏感性，干扰IRS1或用IGF2处理以及抑制miRNAs后乳腺癌细胞的药物敏感性；
5.mTOR抑制剂处理结合干扰FOXO3a后，qRT-PCR检测miRNAs的表达水平，生物信息学分析miRNAs的启动子与FOXO3a的可能结合位点，ChIP-qPCR结合报告基因实验验证FOXO3a对miRNAs的转录调控；
6.体内实验检测干扰IRS1后肿瘤的药物敏感性，ELISA、免疫组化检测乳腺癌患者标本中IGF2、IRS1、p-FOXO3a的表达，软件分析IRS1，p-FOXO3a与乳腺癌患者对药物反应的相关性，以及IRS1与p-FOXO3a的表达相关性。
研究结果：
1.体外细胞实验发现乳腺癌耐药细胞SKBR3/pool2和BT474/HR20对Herceptin的敏感性明显低于相应的亲本细胞，体内裸鼠成瘤实验进一步验证了耐药细胞对Herceptin的耐受性。耐药细胞与亲本细胞中IGF-1R、Akt、S6K、FOXO3a的蛋白表达水平无明显差异，但它们磷酸化水平以及IRS1的蛋白水平在耐药细胞中明显高于亲本细胞；耐药细胞和相应的亲本细胞中IGF1、IGF2和IRS1的mRNA表达水平均未见明显差异，但耐药细胞培养液中IGF2的蛋白含量明显高于亲本细胞；
2.IGF-1R的抑制剂PPP(Picropodophyllin)、Akt的抑制剂MK-22062HCl和mTOR的抑制剂WAY-600处理耐药细胞SKBR3/pool2和BT474/HR20能分别增加耐药细胞对Herceptin的敏感性，干扰IRS1也能增加耐药细胞对Herceptin的敏感性；在亲本细胞中，单独过表达IRS1或单独用IGF2重组蛋白处理对Herceptin的敏感性并无明显影响，但IGF2处理能明显增强过表达IRS1亲本细胞对Herceptin的耐受性；
3.根据在线软件预测可能靶向调控IRS1和IGF2的miRNAs，qRT-PCR检测发现在耐药细胞中可能靶向调控IRS1的miR-128-3p和miR-30a-5p以及可能靶向调控IGF2的miR-193a-5p表达下调；在耐药细胞中过表达miR-128-3p和miR-30a-5p能下调IRS1蛋白水平，反之亦然；在耐药细胞中过表达miR-193a-5p后能下调细胞培养液中IGF2的蛋白水平，反之亦然；报告基因试验进一步验证了乳腺癌细胞中miR-128-3p和miR-30a-5p可直接靶向调控IRS1表达，miR-193a-5p可直接靶向调控IGF2表达；
4.在耐药细胞中过表达miR-128-3p和miR-30a-5p能增加细胞对Herceptin的敏感性，而过表达IRS1能明显抑制过表达miRNAs引起的药物增敏作用；在亲本细胞中，IGF2处理能明显增加miR-128-3p和miR-30a-5p功能抑制后细胞对Herceptin的耐受性，干扰IRS1表达则可逆转IGF2和miRNAs抑制剂协同引起耐药性；
5.在耐药细胞中应用针对mTORC1和mTORC2的抑制剂后，miR-128-3p、miR-30a-5p和miR-193a-5p的表达明显上调，而使用mTORC1的抑制剂后上述miRNAs的表达无明显变化；干扰FOXO3a后可消除由mTOR的抑制剂引起miRNAs的表达水平上调；生物信息学分析miR-128-3p、miR-30a-5p和miR-193a-5p的启动子上可能存在FOXO3a的结合位点，ChIP-qPCR实验发现在亲本细胞中FOXO3a可与miR-128-3p、miR-30a-5p和miR-193a-5p启动子结合，且结合水平均明显高于耐药细胞，报告基因实验验证FOXO3a可以转录调控miR-128-3p、miR-30a-5p和miR-193a-5p的表达，mTOR的抑制剂能明显增强FOXO3a与miR-128-3p、miR-30a-5p和miR-193a-5p启动子的结合水平；
6.裸鼠体内成瘤实验发现干扰IRS1表达能增加耐药细胞来源肿瘤对Herceptin的敏感性，Herceptin耐受组乳腺癌患者血清中IGF2的蛋白含量高于敏感组，同时，耐受组乳腺癌组织中发现IRS1和p-FOXO3a水平高于敏感组，且两者的表达水平呈正相关性。
结论：
1.IGF2和IRS1介导的IGF-1R/Akt/mTOR信号在Herceptin耐受乳腺癌细胞中持续活化并参与Herceptin耐受；
2.miR-128-3p和miR-30a-5p可靶向调控IRS1表达，miR-193a-5p可靶向调控IGF2表达；
3.mTORC2通过抑制FOXO3a活性而转录下调Herceptin耐受细胞中miR-128-3p、miR-30a-5p和miR-193a-5p的表达；
4.IGF2/IRS1/Akt/mTOR/FOXO3a/miRNAs形成正反馈信号环路参与乳腺癌Herceptin耐受。
HER2/ErbB2作为EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor，表皮生长因子受体)家族成员之一，在大约20%~30%的乳腺癌中呈阳性表达，且与乳腺癌发生发展及预后不良相关。赫赛汀(Herceptin)是靶向HER2抗体药物，常用于HER2阳性型乳腺癌的治疗，但是临床上只有不超过35%的HER2阳性型乳腺癌患者对Herceptin治疗敏感，且这些敏感患者在治疗过程中也易形成继发性耐受。因此，阐明HER2阳性型乳腺癌对Herceptin治疗耐受的机制具有十分重要的意义。
研究提示，IGF-1R信号活化与乳腺癌细胞Herceptin耐受相关，本课题组前期研究亦发现IGF-1R可与HER2和HER3形成异源三聚体介导乳腺癌细胞Herceptin耐受，同时发现Herceptin耐受细胞培养液中IGF2蛋白含量升高，耐受细胞中IRS1蛋白表达上调。胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor-2 ， IGF2)可通过与细胞表面特定的受体IGF-1R(insulin-like growth factor-1 receptor)结合激活细胞内各种信号通路而在个体生长发育和肿瘤形成中起重要作用；IGF-1R作为酪氨酸激酶生长因子受体，与其配体IGF2结合后，通过IRS1(subsequently phosphorylates insulin receptor substrate 1)激活下游效应信号通路，抑制细胞凋亡、促进细胞周期进展和血管生成等生物学进程。本研究将以HER2阳性型乳腺癌亲代细胞SKBR3和BT474及其对应的Herceptin耐药细胞SKBR3/pool2和BT474/HR20为模型，进一步探究IGF2/IGF-1R/IRS1信号通路在HER2阳性型乳腺癌Herceptin治疗耐受中的作用及其异常活化的分子机制。
研究方法：
1.采用HER2阳性型乳腺癌亲本细胞SKBR3和BT474及其衍生的Herceptin耐受细胞SKBR3/pool2和BT474/HR20为模型，体外细胞实验结合体内动物实验验证各细胞对Herceptin的敏感性，通过qRT-PCR、ELISA、westernblot实验检测相关基因的表达以及它们的磷酸化水平；
2.通过MTS检测经相关抑制剂处理或干扰IRS1后细胞的药物敏感性，以及用IGF2处理和过表达IRS1后细胞的药物敏感性；
3.通过生物信息学分析miRNAs可能与IRS1和IGF2mRNA的3-UTR结合，qRT-PCR验证miRNAs在耐药细胞中的表达，westernblot、ELISA、报告基因试验检测miRNAs对IRS1和IGF2的调控作用；
4.MTS检测过表达IRS1或过表达miRNAs后细胞的药物敏感性，干扰IRS1或用IGF2处理以及抑制miRNAs后乳腺癌细胞的药物敏感性；
5.mTOR抑制剂处理结合干扰FOXO3a后，qRT-PCR检测miRNAs的表达水平，生物信息学分析miRNAs的启动子与FOXO3a的可能结合位点，ChIP-qPCR结合报告基因实验验证FOXO3a对miRNAs的转录调控；
6.体内实验检测干扰IRS1后肿瘤的药物敏感性，ELISA、免疫组化检测乳腺癌患者标本中IGF2、IRS1、p-FOXO3a的表达，软件分析IRS1，p-FOXO3a与乳腺癌患者对药物反应的相关性，以及IRS1与p-FOXO3a的表达相关性。
研究结果：
1.体外细胞实验发现乳腺癌耐药细胞SKBR3/pool2和BT474/HR20对Herceptin的敏感性明显低于相应的亲本细胞，体内裸鼠成瘤实验进一步验证了耐药细胞对Herceptin的耐受性。耐药细胞与亲本细胞中IGF-1R、Akt、S6K、FOXO3a的蛋白表达水平无明显差异，但它们磷酸化水平以及IRS1的蛋白水平在耐药细胞中明显高于亲本细胞；耐药细胞和相应的亲本细胞中IGF1、IGF2和IRS1的mRNA表达水平均未见明显差异，但耐药细胞培养液中IGF2的蛋白含量明显高于亲本细胞；
2.IGF-1R的抑制剂PPP(Picropodophyllin)、Akt的抑制剂MK-22062HCl和mTOR的抑制剂WAY-600处理耐药细胞SKBR3/pool2和BT474/HR20能分别增加耐药细胞对Herceptin的敏感性，干扰IRS1也能增加耐药细胞对Herceptin的敏感性；在亲本细胞中，单独过表达IRS1或单独用IGF2重组蛋白处理对Herceptin的敏感性并无明显影响，但IGF2处理能明显增强过表达IRS1亲本细胞对Herceptin的耐受性；
3.根据在线软件预测可能靶向调控IRS1和IGF2的miRNAs，qRT-PCR检测发现在耐药细胞中可能靶向调控IRS1的miR-128-3p和miR-30a-5p以及可能靶向调控IGF2的miR-193a-5p表达下调；在耐药细胞中过表达miR-128-3p和miR-30a-5p能下调IRS1蛋白水平，反之亦然；在耐药细胞中过表达miR-193a-5p后能下调细胞培养液中IGF2的蛋白水平，反之亦然；报告基因试验进一步验证了乳腺癌细胞中miR-128-3p和miR-30a-5p可直接靶向调控IRS1表达，miR-193a-5p可直接靶向调控IGF2表达；
4.在耐药细胞中过表达miR-128-3p和miR-30a-5p能增加细胞对Herceptin的敏感性，而过表达IRS1能明显抑制过表达miRNAs引起的药物增敏作用；在亲本细胞中，IGF2处理能明显增加miR-128-3p和miR-30a-5p功能抑制后细胞对Herceptin的耐受性，干扰IRS1表达则可逆转IGF2和miRNAs抑制剂协同引起耐药性；
5.在耐药细胞中应用针对mTORC1和mTORC2的抑制剂后，miR-128-3p、miR-30a-5p和miR-193a-5p的表达明显上调，而使用mTORC1的抑制剂后上述miRNAs的表达无明显变化；干扰FOXO3a后可消除由mTOR的抑制剂引起miRNAs的表达水平上调；生物信息学分析miR-128-3p、miR-30a-5p和miR-193a-5p的启动子上可能存在FOXO3a的结合位点，ChIP-qPCR实验发现在亲本细胞中FOXO3a可与miR-128-3p、miR-30a-5p和miR-193a-5p启动子结合，且结合水平均明显高于耐药细胞，报告基因实验验证FOXO3a可以转录调控miR-128-3p、miR-30a-5p和miR-193a-5p的表达，mTOR的抑制剂能明显增强FOXO3a与miR-128-3p、miR-30a-5p和miR-193a-5p启动子的结合水平；
6.裸鼠体内成瘤实验发现干扰IRS1表达能增加耐药细胞来源肿瘤对Herceptin的敏感性，Herceptin耐受组乳腺癌患者血清中IGF2的蛋白含量高于敏感组，同时，耐受组乳腺癌组织中发现IRS1和p-FOXO3a水平高于敏感组，且两者的表达水平呈正相关性。
结论：
1.IGF2和IRS1介导的IGF-1R/Akt/mTOR信号在Herceptin耐受乳腺癌细胞中持续活化并参与Herceptin耐受；
2.miR-128-3p和miR-30a-5p可靶向调控IRS1表达，miR-193a-5p可靶向调控IGF2表达；
3.mTORC2通过抑制FOXO3a活性而转录下调Herceptin耐受细胞中miR-128-3p、miR-30a-5p和miR-193a-5p的表达；
4.IGF2/IRS1/Akt/mTOR/FOXO3a/miRNAs形成正反馈信号环路参与乳腺癌Herceptin耐受。