脑卒中是神经系统的常见病,其发病率、死亡率与致残率高,严重危害人类的健康与生命。脑卒中可以分为缺血性和出血性两大类,其中缺血性脑卒中是因脑部血液供应障碍、缺血缺氧导致局部组织坏死、软化,从而引起局灶性或完全神经功能缺损的症状。缺血性脑卒中约占所有卒中病例的85%,其损伤的核心机制在于脑组织的缺血、缺氧及再灌注损伤。组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator, tPA)是目前美国食品药物监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)唯一批准用于缺血性脑卒中急性期治疗的药物,然而tPA适用范围局限,副作用多,且在促进再灌注以及改善长期临床症状方面的益处有限。近年来人们致力于研究脑缺血急性期的神经损伤性级联反应,并已发现了很多具有神经保护作用的化合物,但临床效果均不甚理想。因此,阐明脑卒中确切的病理机制,探索新的神经保护策略和有效的脑卒中治疗措施仍然是当前亟待解决的问题。米格列奈(mitiglinide, MGN)属苯丙氨酸衍生物,是非磺酰脲类口服降糖药,MGN特异性作用于胰岛p细胞的磺酰脲受体1(sulphonylurea receptor, SUR1)亚基使ATP敏感性钾离子(ATP-sensitive potassium channel, KATP)通道关闭、细胞膜去极化、电压依赖性钙通道开放、Ca2+内流,从而促进胰岛素分泌。研究发现,米格列奈具有降低餐后氧化应激和炎症因子的作用,可以增强缺血预处理对心肌缺血的保护作用。糖尿病作为心脑血管疾病的独立危险因素,可致脑卒中患病风险增加2～5倍,目前已有多种糖尿病药物被报道具有预防或治疗缺血性脑卒中的作用。最新文献报道,受SUR1调节的KATP通道和钙离子依赖的ATP敏感性非选择性单阳离子(nonselective cation channel regulated by intracellular calcium and adenosine triphosphate, NCca2+ -ATP)通道广泛分布于神经血管单元(neurovascular unit,NVU)各组分,与中枢神经系统损伤如脑缺血、创伤性脑损伤、脊髓损伤以及蛛网膜下腔出血等病理机制密切相关,那么作用于SUR1的米格列奈是否对缺血性脑卒中具有神经保护和损伤修复的作用,其中潜在的机制又是什么?目前尚未见报道。鉴于上述,本文工作首先研究了米格列奈对脑缺血再灌注模型鼠急性期损伤的作用,并进行了米格列奈治疗缺血性脑卒中的临床前药效评价,发现无降糖作用的低剂量米格列奈具有神经保护作用,揭示了米格列奈的药理学新作用。第二部分工作研究了米格列奈对脑缺血再灌注小鼠急性期NVU结构与功能的影响以及对神经损伤信号级联的作用,阐明了米格列奈的神经保护作用机制；应用Kir6.1敲减(Kir6.1 heterozygote knockout, Kir6.1+/-)和Kir6.2敲除(Kir6.2homozygote knockout, Kir6.2-/-)模式小鼠制备暂时性中动脉栓塞(transient middle cerebral artery occlusion, tMCAo)模型,揭示了米格列奈神经保护作用的可能靶点。第三部分工作研究了米格列奈对脑缺血再灌注小鼠感觉与运动以及认知功能恢复的影响。结果显示,米格列奈促进脑缺血再灌注恢复期的功能恢复与病灶区神经再生,具有促神经修复作用。本研究工作首次发现了米格列奈对缺血性脑卒中损伤具有治疗和促修复作用,揭示了米格列奈新的药理学作用,为脑卒中的临床治疗学提供了新的思路和策略。第一部分 米格列奈对缺血性脑卒中模型鼠急性期损伤的治疗学作用目 的：研究米格列奈对缺血性脑卒中损伤的保护作用,开展米格列奈的临床前药效学评价。方法：应用2-3月龄雄性C57BL/6J小鼠,采用线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型,于复灌后1小时灌胃给予瑞格列奈(0.005、0.025和0.1 mg/kg)、那格列奈(2.5、5和10 mg/kg)和米格列奈(0.01、0.025、0.05、0.1、0.3、0.4、1、3和6 mg/kg),通过断尾取血测血糖、神经运动功能缺陷评分、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC)染色计算脑梗死体积和脑含水量的变化确定以米格列奈为代表的格列奈类药物对脑缺血再灌注急性期损伤的作用及有效剂量,并进一步研究代表药物米格列奈对脑缺血再灌注急性期损伤的治疗时间窗；应用Sprague-Dawley (SD)大鼠建立两种不同缺血性脑卒中模型(transient middle cerebral artery occlusion, tMCAo; permenant middle cerebral artery occlusion, pMCAo)评价米格列奈对缺血性脑卒中的治疗效果。应用多普勒激光血流仪和二维激光散斑成像技术实时监测脑缺血再灌注过程中实验小鼠的局部脑血流变化；应用尼氏染色技术观察米格列奈对tMCAo、鼠脑组织病理学形态变化的影响。结果：1)应用血流监测筛选模型成功小鼠,于复灌后1小时灌胃给予无降糖效应的低剂量米格列奈可显著改善tMCAo所致神经功能障碍,并相应减小其脑梗死体积,初步确定米格列奈对脑缺血再灌注损伤的保护作用,其有效剂量范围是0.05～1 mg/kg; 2)分别于复灌1 h灌胃给予低、中、高三个剂量的格列奈类药物,确证格列奈类药物在无降糖作用的低剂量范围内对神经功能障碍、脑梗死和脑水肿均具有显著改善作用；3)米格列奈(0.4 mg/kg)显著改善tMCAo所致神经细胞减少；4)米格列奈(0.4 mg/kg)不影响脑缺血过程中病灶区脑血流的变化(P>0.05)；5)复灌6小时后给予米格列奈(0.4 mg/kg)显著降低脑缺血再灌注急性期的神经功能评分、脑梗死体积和脑含水量(P<0.05),9小时后给药这些损伤指标有下调的趋势,但没有显著性差异(P>0.05),12小时后给药这些损伤指标与模型组之间无显著性差异(P>0.05)；6)米格列奈显著改善tMCAo和pMCAo脑卒中模型大鼠的神经运动功能障碍,并降低其脑梗死体积和脑含水量。结论：1.以米格列奈为代表的格列奈类药物在不降糖的低剂量范围内对小鼠脑缺血再灌注急性期损伤具有实验治疗学作用；米格列奈对脑缺血再灌注的治疗时间窗超过6小时。2.米格列奈显著改善tMCAo所致小鼠脑组织形态学损伤,但不影响局部脑血流的变化。3.米格列奈对脑缺血再灌注的治疗时间窗超过6小时。4.低剂量米格列奈对不同缺血性脑卒中模型大鼠的急性期损伤具有神经保护作用。第二部分米格列奈对脑缺血再灌注小鼠急性期损伤的神经保护作用及其机制目 的：研究、阐明米格列奈对脑缺血再灌注所致神经血管单元病理改变的作用及其机制。方法：应用2-3月龄雄性C57BL/6J小鼠,采用线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型,于复灌后1小时灌胃给予米格列奈(0.4mg/kg),复灌24或72小时处死动物收集标本。应用免疫组织化学法和免疫荧光标记观察不同脑区(损伤侧纹状体和皮层)NVU各组分(神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和血管内皮细胞基底膜等)的形态学变化,并通过体式学计数进行定量分析。应用Western blotting技术和Image J软件半定量分析基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9, MMP-9)及其底物occludin,凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell leukemia/lymphoma 2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase) 3,内质网应激标志性分子葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated protein78, GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein, Chop)及caspase 12,炎症相关信号核转录因子kappa B (nuclear factor kappa B, NF-κB)p65亚基与炎症因子白介素-1p (interleukin-1 beta, IL-1β)的产生和成熟。通过检测脑组织匀浆中丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活性研究米格列奈对脑缺血再灌注所致脂质氧化和还原的影响。应用2～3月龄雄性野生型(wild type, WT)、Kir6.2-/-和Kir6.1+/-小鼠制备tMCAo模型,复灌1小时灌胃给予米格列奈(0.4mg/kg),通过神经运动功能评分、TTC染色和脑含水量的测定观察米格列奈对脑缺血再灌注急性期损伤保护作用的改变。结果：1)米格列奈显著减轻脑缺血再灌注急性损伤期小鼠患侧皮层与纹状体脑区神经元的死亡,抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖和活化；2)米格列奈显著降低缺血半影区MMP-9的表达,并减轻其底物蛋白occludin和collagen IV的降解；3)米格列奈显著降低tMCAo小鼠缺血半影区的细胞凋亡、内质网应激和氧化应激水平；4)米格列奈显著下调tMCAo小鼠缺血半影区p65亚基的核转位并抑制炎症因子IL-1β的表达；5)米格列奈显著改善脑缺血再灌注所致WT小鼠的神经运动功能障碍,减少其脑梗死体积和脑含水量；Kir6.2基因敲除不影响米格列奈的神经保护作用(P<0.05),但是Kir6.1基因敲减取消米格列奈的神经保护作用(P>0.05)。结论：1.米格列奈减轻脑缺血再灌注所致小鼠脑内神经血管单元的病理损伤。2.米格列奈抑制脑缺血再灌注所致小鼠神经细胞凋亡、内质网应激、氧化应激和炎症反应,从而发挥其神经保护作用。3.米格列奈的神经保护作用不依赖Kir6.2/KATP通道,可能与Kir6.1/KATP通道相关。第三部分 米格列奈对脑缺血再灌注小鼠恢复期脑内神经再生与运动认知功能的调节目 的：研究米格列奈对小鼠脑缺血再灌注损伤恢复期感知运动等功能和神经再生的影响。方法：应用2～3月龄雄性C57BL/6J小鼠,采用线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型,于复灌后1小时灌胃给予米格列奈(0.4 mg/kg),每天给药一次,持续到处死动物当天,统计小鼠死亡率。应用转角测试、圆柱体测试、踏空实验和转棒实验等四种方法动态观察米格列奈对脑缺血再灌注损伤后感知和运动功能不同阶段恢复水平的影响。应用水迷宫测试评价米格列奈对脑缺血再灌注后期认知与记忆能力缺陷的作用。缺血后第29天经腹腔注射5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU,50 mg/kg),于不同时间段灌注固定,冰冻切片后通过免疫组织化学法和免疫荧光双标并体式学计数观察米格列奈对脑缺血再灌注后期干细胞增殖(BrdU on Day 30)、存活(BrdU on Day 58)及分化(BrdU/NeuN、BrdU/GFAP)的影响。结果：1)米格列奈显著提高脑缺血再灌注小鼠的存活率；2)脑缺血再灌注后小鼠向右转向的频率、非损伤前肢的运动率和足失误率逐渐降低,其转棒停留时间亦同步逐渐增加,给予米格列奈长期治疗可显著加速该功能恢复；3)给予米格列奈长期治疗显著减少脑缺血再灌注后期小鼠在水迷宫实验中的平台潜伏期并相应增加其在目的象限的停留时间；4)米格列奈显著增加tMCAo小鼠后期不同时间(30 d和58 d)室管膜下区(subventricular zone, SVZ)和齿状回颗粒下区(subgranular zone, SGZ)脑区的BrdU阳性细胞的数目；5)给予米格列奈长期治疗显著增加损伤病灶区皮层和纹状体中BrdU和BrdU/NeuN阳性的细胞数目。结论：1.米格列奈促进脑缺血再灌注损伤后小鼠的长期存活与感觉运动功能的恢复,并改善小鼠的学习忆能力。2.米格列奈促进脑缺血再灌注损伤后期的神经再生。综上所述,本文工作的主要创新之处在于：1.揭示无降糖作用的低剂量米格列奈对缺血性脑卒中模型鼠的神经损伤具有保护作用 通过多种缺血性脑卒中模型动物的研究发现,无降糖效应的低剂量米格列奈对缺血性脑卒中的急性期损伤包括神经功能障碍、脑梗死和脑水肿均具有显著改善作用,揭示了降糖药物米格列奈对缺血性脑卒中所致急性损伤的神经保护作用,拓展了米格列奈的药理新用途,为临床防治脑卒中提供了新的候选药物与治疗策略。2.揭示米格列奈是靶向于神经损伤多元病理机制的神经血管单元保护剂研究发现米格列奈可能通过调节NVU功能、阻断脑缺血引发多重损伤级联反应(凋亡、内质网应激、炎症、氧化应激等),从而对急性期损伤发挥神经保护作用；Kir6.2敲除不影响米格列奈对脑缺血再灌注急性损伤的保护作用,而Kir6.1敲减取消米格列奈对tMCAo所致急性损伤的保护作用,提示米格列奈的作用靶点可能是Kir6.1/KATP通道。研究结果提示米格列奈是靶向于神经损伤多元病理机制的神经血管单元保护剂,为研发神经保护药物的新靶点积累了学术基础。3.揭示米格列奈具有促进脑缺血再灌注小鼠后期修复的作用 米格列奈不仅提高tMCAo小鼠的长期存活率,改善其感觉运动和认知记忆功能失调,同时还促进后期神经再生与修复,为将米格列奈发展成为脑卒中临床治疗和康复的理想药物提供了实验依据。