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目的随着医疗水平的提高,全世界每年有数以百万计的婴幼儿因手术需要接受麻醉暴露。婴幼儿阶段是神经系统发育的高峰期和敏感期,其中枢神经系统较成人更容易受到麻醉药物的损害。目前全身麻醉药致认知功能损伤的机制可能与细胞凋亡、中枢炎症反应、氧化应激、Aβ聚集等有关。七氟烷因动态稳定性好、呼吸道刺激性小、消除快等特点而成为儿科最常用的全身麻醉药物之一。但是,与其他麻醉药物一样,七氟烷可引起神经元凋亡和认知功能损伤,其机制尚不清楚。表观遗传学(Epigenetics)是DNA序列不发生改变的情况下,基因表达发生改变并产生可遗传表型的科学,其主要通过DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA干扰等方式调控基因的表达。其中DNA甲基化修饰在学习记忆中的作用越来越受到关注。突触可塑性被认为是构成学习记忆的重要神经化学基础,其损害可导致认知功能损伤。近年来对于突触可塑性机制的研究主要集中于突触可塑性相关蛋白的研究。脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是中枢神经系统中广泛存在的一类参与神经元发育、分化和存活的营养因子。络丝(Reelin)蛋白是一种细胞外基质蛋白,参与神经元的迁移和定位,在脑发育过程中具有重要作用。蛋白磷酸酶1(Protein phosphatases 1, PP1)是丝氨酸／苏氨酸特异性的磷酸酶,广泛参与信号转导过程,与学习记忆过程密切相关。这些突触可塑性相关基因的表达受多种机制调控,其中包括DNA甲基化。我们推测,突触可塑性相关基因甲基化的改变可能参与七氟烷暴露致新生大鼠认知功能损伤的发生发展。本研究中,运用七氟烷致认知功能损伤的动物模型,从突触可塑性相关基因甲基化、基因表达水平及树突棘数目的变化,探讨七氟烷损害发育期大脑认知功能的可能机制,为其防治提供新的理论依据和重要干预靶点。方法出生后7 d(P7)雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,吸入3%七氟烷+30%O2 (2L/min) 2h,连续吸入3 d(P7-9),建立七氟烷致认知功能损伤的动物模型。七氟烷吸入前1 h,分别侧脑室注射5-氮杂-2’-脱氧胞苷(1 mg/kg,2 μl; 5-Aza-2’-deoxycytidine,5-AZA, DNA甲基转移酶抑制剂)或等容二甲基亚砜(Dimethyl sulphoxide, DMSO)。第一批大鼠(n=60)用于认知行为学研究,随机均分为以下五组：对照组(Control组)、对照+5-AZA组(Control+5-AZA组)、七氟烷组(Sevoflurane组)、七氟烷+DMSO组(Sevoflurane+DMSO组)及七氟烷+5-AZA组(Sevoflurane+5-AZA组)；第二批大鼠(n=176)用于生化检测,随机均分为以下四组：Control组、Sevoflurane组、Sevoflurane+DMSO组及Sevoflurane+5-AZA组。第一批大鼠分别在P39、P41-43和P50-57行旷场实验(Open field test, OF)、场景性条件性恐惧实验(Fear conditioning test, FC)和Morris水迷宫实验(Morris water maze test, MWM)检测大鼠运动和学习记忆能力。第二批大鼠在七氟烷暴露后1、6、24 h和30 d,断头取脑,进行生化指标的检测。采用高尔基染色检测七氟烷暴露后30 d大鼠海马区锥体神经元树突棘的数目；采用实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)及免疫印迹(Western blotting, WB)检测海马区DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)、甲基胞嘧啶结合蛋白2 (Methyl-CpG binding protein 2, MeCP2)、BDNF、Reelin和PP1的mRNA和蛋白水平；采用甲基特异性qPCR (MSP)检测七氟烷暴露后6 h和30 d海马区BDNF和Reelin基因的甲基化水平。结果场景性恐惧实验测试阶段,与Control组比较,Sevoflurane组僵直反应明显减少(P<0.05)；与Sevoflurane+DMSO组比较,Sevoflurane+5-AZA组僵直反应明显增加(P<0.05)。水迷宫实验中,与Control组比较,Sevoflurane组于第3-7天逃避潜伏期明显延长,在目标象限停留时间明显缩短(P<0.05)；与Sevoflurane+DMSO组比较,Sevoflurane+5-AZA组于第5-7天逃避潜伏期明显缩短,在目标象限停留时间明显延长(P<0.05)。高尔基染色中,与Control组相比,Sevoflurane组在七氟烷暴露后30 d大鼠海马区的锥体神经元树突棘数目明显减少(P<0.05)；与Sevoflurane+DMSO组相比,Sevoflurane+5-AZA组在七氟烷暴露后30 d海马区锥体神经元树突棘数目明显增加(P<0.05)。在qPCR及WB检测中,与Control组相比,Sevoflurane组海马区DNMT3a和DNMT3b的mRNA和蛋白水平在七氟烷暴露后6、24 h和30 d明显增加(P<0.05); MeCP2、BDNF和Reelin的mRNA水平在七氟烷暴露后6、24 h和30 d明显减少(P<0.05)；其蛋白水平在七氟烷暴露后24 h和30 d明显减少(P<0.05)；提前给予5-AZA可逆转七氟烷暴露引起的以上变化。在MSP检测中,与Control组相比,Sevoflurane组海马区BDNF和Reelin基因的甲基化水平在七氟烷暴露后6 h和30 d明显增加(P<0.05)；与Sevoflurane+DMSO组比较,Sevoflurane+5-AZA组BDNF和Reelin基因的甲基化水平在七氟烷暴露后6 h及30 d明显减少(P<0.05)。结论七氟烷暴露可引起新生大鼠远期认知功能损伤,可能与突触可塑性相关基因BDNF和Reelin甲基化水平增加,导致BDNF和Reelin表达降低,进一步引起海马区锥体神经元树突棘数目减少有关。DNA甲基转移酶抑制剂5-AZA预处理可明显改善这些损伤。本研究结果表明七氟烷致新生大鼠远期认知功能损伤与海马内突触可塑性相关基因BDNF和Reelin的高甲基化密切相关。