研究背景与目的鼻咽癌是发生于鼻咽粘膜的一种上皮来源的恶性肿瘤,具有明显的地区聚集性。在中国,鼻咽癌高发于华南地区,特别是中国南方的广东省是全世界最高发的地区,所以鼻咽癌又有“广东癌”之称。鼻咽癌起病隐匿,恶性程度高,转移早,对放化疗敏感。如今,鼻咽癌治疗失败的主要原因是远处转移,而不是局部或区域的复发。其发生是一个多阶段、多途径、多机制、多遗传变异积累的复杂过程,其危险因素包括EB病毒、家族癌史、腌制食品、吸烟、居住环境中的烟尘暴露、工作环境中粉尘、烟和化学蒸汽的暴露、耳鼻咽喉病史等。鼻咽癌的肿瘤形成涉及多个基因和多条信号通路改变,癌基因的激活与抑癌基因的失活以及它们之间相互作用的失衡是鼻咽癌发生发展的分子基础。因此,探索与鼻咽癌相关的重要基因及其介导的信号通路将有助于进一步揭示鼻咽癌的发病机理。细胞癌变需要突破四道屏障：①控制细胞分裂的细胞周期阻抑；②控制细胞增殖的凋亡；③限制细胞分裂总次数的端粒酶；④阻滞细胞转移的细胞粘附屏障。由于环境暴露、先天遗传、慢性炎症和衰老等因素导致局部或全身组织“生态”改变,削弱了这些屏障作用,使间叶组织中的癌症起始细胞获得进化机会,导致基因组不稳定、基因变异和基因异常表达。目前越来越多的证据表明癌症起始细胞是一类可以自我更新、具有多向分化潜能、具有耐药性的肿瘤干细胞,越来越多的研究集中在如何杀死肿瘤干细胞,从而达到治疗的目的。ZEB2(又叫SIP1; SIP-1; ZFHX1B; HSPC082; SMADIP1),由2q22染色体上的ZFHX1B基因所编码,包含9个外显子和8个内含子,CDS区为3572bp。属于锌指结构转录因子中的E盒结合锌指蛋白(zinc finger E-box-binding protein,ZEB)家族的成员,ZEB2包含2个锌指簇(zinc-finger cluster)和连接这两个锌指簇的可变序列。N端和C端中的每一个锌指结构都能够独立结合目的基因的受调节区域中的5’-CACCT (G)序列。是胚胎发育中必需的转录因子,首次关于ZEB2的报道是在非洲爪蟾的胚胎中发现了ZEB2的mRNA,后续的研究也揭示了ZEB2在胚胎发育早期中的作用。神经系统发育的早期ZEB2即开始表达,在神经胚形成期ZEB2转录被激活,ZEB2mRNA在人、小鼠的周围神经系统及中枢神经系统发育早期阶段就开始表达。在小鼠胚胎中,ZEB2表达于脊索、体节、四肢、神经嵴、大脑内部及脊髓。成鼠、大于25周的胎儿的神经组织中均表达ZEB2,在非神经组织(如胸腺、心脏、肝脏、骨骼肌、肾、膀胱等)也可检测到ZEB2的表达。成年人起源于外胚层的器官均表达ZEB2,包括表皮、晶状体、腺、毛、齿、甲、神经管、脑、神经嵴、内耳迷路等。ZEB2在胚胎发育早期开始表达,并于成熟阶段表达明显,表明ZEB2在调节神经元功能方面发挥了重要作用。ZEB2基因的突变会引起Hirschsprung disease(先天性巨结肠)和Mowat-Wilson syndrome,后者主要表现为智力低下、发育障碍、癫痫、小头畸形、胼胝体发育不全。ZEB2属于转录因子,最初的研究认为ZEB2定位于核内,最近的研究表明,ZEB2在胞浆及胞核中均有表达。它参与细胞生长、分化、凋亡、胚胎发育及炎症反应等多种生命活动的调控。目前认为ZEB家族参与肿瘤的进展过程,因而可能具有临床意义。已有的文献报道,在卵巢癌中,ZEB2在癌性渗出液中的表达量高于原发灶；在乳腺癌、口腔鳞癌中,ZEB2高表达预示着总生存期较短,预后不良；在胃癌中,ZEB2在肠型胃癌中表达比较高,与组织学类型相关；在四种神经胶质瘤中,ZEB2的表达量都非常高,ZEB2的表达量与肿瘤的侵袭转移正相关,并且有可能作为胶质瘤的治疗靶点和诊断依据；在肾癌中,ZEB2高表达预示根治性肾癌切除术后易复发；在非小细胞肺癌中,ZEB2的表达量与T分期、肿瘤直径、临床分期正相关,与患者的术后生存期负相关；在结直肠癌中,ZEB2的癌组织的侵袭边缘过表达,促进病情进展,有可能作为诊断的生物标记物或者作为结直肠癌的治疗靶点；在胰腺癌中,ZEB2的高表达,促进病情进展；在肝细胞性肝癌中,与癌旁组织相比,ZEB2的表达量降低；癌旁细胞的胞浆内ZEB2的表达量预示着手术后生存期相对较长；而在黑色素瘤中,Florian A. Karreth等人则发现,ZEB2的低表达,可以促进黑色素瘤的形成,促进细胞发生转化和克隆形成。ZEB2在鼻咽癌中的作用及其机制,目前主要是针对ZEB2促进EMT展开。经典的Wnt通路在很多种肿瘤中促进细胞的增殖、转移,高水平的P-catenin是小肠干细胞保持未分化状态、不分化成小肠壁特异细胞的重要保证,而这种高水平的β-catenin也被证明是结肠癌形成的重要因素。Wnt/β-Catenin通路在促进EMT、维持干细胞的干性等方面起重要作用。我们的前期研究中也发现ZEB2可以在Wnt/β-Catenin通路的上游起作用。而ZEB2在鼻咽癌中的表达量、对于鼻咽癌的发生发展等影响,目前仍然没有明确的报道。由此,我们设计了本课题,研究ZEB2在鼻咽癌中所起的功能及其分子机制。研究目的1.研究ZEB2在鼻咽癌细胞株以及鼻咽癌组织中的表达特性；2.研究ZEB2对鼻咽癌细胞增殖的影响；3.研究ZEB2对鼻咽癌细胞凋亡的影响；4.研究ZEB2对鼻咽癌细胞侵袭转移能力的影响；5.研究ZEB2对肿瘤干细胞“干性”的影响。研究内容与方法1.ZEB2在鼻咽癌细胞株以及鼻咽癌组织中的表达特性的鉴定1)利用RT-PCR和Western blot分别检测ZEB2在鼻咽癌细胞株SUNE-1Ο5-8F、CNE-1、CNE-2、HNE-1、HONE-1、6-10B、C666-1和非癌细胞株NP-69中的mRNA水平；2)免疫组化SP法检测鼻咽癌组织、非癌鼻咽组织中ZEB2的表达情况；3)荧光定量PCR检测ZEB2在不同临床分期的鼻咽癌组织中的表达情况。2.ZEB2在鼻咽癌中对增殖的影响及其分子机制1)采用RNA干扰技术下调ZEB2在5-8F和SUNE-1中的表达；采用荧光定量PCR鉴定干扰效率,选择干扰片段进行后续实验；采用免疫荧光、Western blot的方法检测ZEB2的干扰效率；2)下调ZEB2的表达后,流式细胞仪检测不同处理组中,鼻咽癌细胞的周期分布的变化；3)EDU增殖实验检测干扰ZEB2后,鼻咽癌细胞中处于S期的细胞比例的变化；4) Western Blot检测下调ZEB2表达后,细胞周期相关蛋白的变化,寻找ZEB2调控周期的相关信号通路。3.ZEB2对凋亡的影响及其分子机制1)流式细胞仪检测下调ZEB2的表达后,凋亡细胞比例的变化；2) Western blot检测凋亡相关蛋白的变化；寻找ZEB2影响凋亡的机制；3)MTT检测下调ZEB2表达后,药物剂量反应的改变。4.ZEB2对鼻咽癌侵袭转移的影响及其分子机制1) siRNA干扰ZEB2后,进行Transwell体外运动迁移实验；2) siRNA干扰ZEB2后,进行Boyden体外侵袭转移实验；3) Western Blot验证干扰ZEB2后,EMT相关的信号通路的变化,探索其影响EMT的分子机制。5、ZEB2对鼻咽癌干细胞“干性”的影响1)培养肿瘤球,提取贴壁细胞和肿瘤球细胞的蛋白,Western blot检测干性相关的蛋白；提取肿瘤球和贴壁细胞的RNA,荧光定量PCR检测肿瘤球中ZEB2的表达；2) siRNA干扰ZEB2后,FACS检测侧群比例；3) siRNA干扰ZEB2后,检测与“干性”相关的基因的蛋白水平的变化；4) siRNA干扰ZEB2后,进行miRNA芯片检测；寻找ZEB2可能调控的microRNAs。6、统计学分析：采用SPSS16.0统计软件进行数据分析。计量资料结果用x±s表示。荧光定量PCR各细胞样本的2-△△Ct值的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),如有统计学差异,多重比较用Dunnett法；两组间率的比较采用四格表χ2检验；不同处理组问的比值、穿膜细胞数等采用两独立样本t检验；用Cox回归模型做生存分析；MTT检测药物剂量反应采用析因设计资料的方差分析进行统计,如有统计学意义,两组间相同药物剂量的OD值比较采用两独立样本t检验,同样的处理组不同药物浓度的OD值采用One-Way ANOVA,如有统计学差异,不同的药物剂量组间进行Dunnett多重比较；以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.与NP69相比,ZEB2在鼻咽癌细胞株5-8F、CNE2、SUNE-1中表达量增高；ZEB2在鼻咽癌组织中表达强度高于非癌鼻咽组织,且ZEB2的表达强度与N分期、M分期、临床分期、脉管浸润正相关,ZEB2表达量与患者的生存期呈反比；ZEB2在临床分期Ⅲ-Ⅳ级的鼻咽癌组织中的表达量高于临床分期Ⅰ-Ⅱ级鼻咽癌组织中的表达量。1)通过荧光定量PCR的方法检测8株鼻咽癌细胞以及鼻咽永生化上皮细胞NP69中ZEB2mRNA的表达情况,单因素方差分析的结果表明,8株鼻咽癌细胞和永生化鼻咽上皮细胞NP69中ZEB2的表达差异具有显著性(F=58.779,P<.001). Dunnett多重比较结果显示,NP69分别与5-8F、SUNE-1、CNE-2之间,ZEB2的表达有差异,其差异具有统计学意义(P值均<0.001)；2) Western blot检测8株鼻咽癌细胞和鼻咽永生化上皮细胞NP69中,ZEB2蛋白的表达情况,以GAPDH为内参。结果表明,与NP69相比,ZEB2在鼻咽癌细胞5-8F、CNE-2、6-10B、SUNE-1、HNE-1中的表达均上调。结合Q-PCR结果,最后选定5-8F和SUNE-1两株细胞进行后续的细胞生物学等方面的实验；3)免疫组化结果显示,ZEB2主要在细胞浆中表达,部分细胞中也可见核表达。与鼻咽部非癌组织相比,ZEB2在鼻咽癌组织中的表达显著增高,具有显著性差异(χ2值为4.517,P=0.038)。经统计分析,不同性别、年龄、组织学类型和T分期的患者中,ZEB2的表达量无差异(P值分别为0.572,0.510,0.766,0.101)。ZEB2的表达量在N2-N3分期的NPC组织中高于N0-N1分期(p=0.002)；在临床分期Ⅲ-Ⅳ期的NPC组织中的表达高于Ⅰ-Ⅱ期的NPC组织(p=0.001)；在M1期鼻咽癌组织中的表达高于M0期(p=0.144)；在有脉管浸润的NPC组织中的表达高于无脉管浸润的NPC组织(P=0.040)；4)经单因素生存分析,ZEB2高表达的患者,预后不良(P=0.001)。除此之外,N分期(P=0.014)、M分期(P=0.000)以及临床分期(P=0.005)亦可影响患者的总体生存期。多因素生存分析结果表明,ZEB2表达(P=0.012)以及M分期(P=0.000)可以独立影响患者预后,而N分期(P=0.706)和临床分期(P=0.113)均不构成独立影响因素。Cox回归结果显示,ZEB2表达量高的患者的生存期与ZEB2表达量低的患者之间有差异(P=0.001),表明ZEB2的表达量与患者的生存期成反比,ZEB2高表达的患者,预后不良；5)提取不同临床分期的鼻咽癌组织的RNA,逆转录后进行Real-time Q-PCR。结果显示,临床分期Ⅲ-Ⅳ期的鼻咽癌组织中的ZEB2表达量高于临床分期Ⅰ-Ⅱ期鼻咽癌组织中的标本(P<0.001)。2.ZEB2在鼻咽癌中抑制增殖及其分子机制1) siRNAs瞬时转染5-8F、SUNE-1后,分别于转染后的24小时、48小时鉴定干扰效率,最后选定siRNA001号干扰片段进行后续的实验,siRNA001于瞬转5-8F和SUNE-1后48小时的干扰效率分别为78%和76%；2)流式细胞仪检测细胞周期后结果显示,在5-8F和SUNE-1中,下调ZEB2表达后,G1期细胞减少(P值分别为0.034和0.037)；S期细胞增高(P值分别为0.001和0.019)；而G2期则无变化(P值分别为0.189和0.116)；3)EDU增殖实验结果显示,下调ZEB2的表达后,5-8F和SUNE-1细胞中处于S期的比例增高,差异具有统计学意义,(P=0.001和P<0.001)；4) Western Blot检测结果显示,下调ZEB2的表达后,CCND1、phospho-Rb上调。3.ZEB2抑制鼻咽癌细胞发生凋亡及其分子机制1)下调ZEB2的表达后,5-8F和SUNE-1的早期凋亡细胞比例增加(P=0.035和P=0.001)；2)免疫荧光结果显示,下调ZEB2的表达后,FoxO1表达量增加；3) Western blot结果显示,ZEB2的表达降低后,与凋亡相关的蛋白bcl-2下调,cleaved-caspase3、cleaved-caspase-9、Bim、cleaved-PARP增高,p-FAK;和p-PI3K的表达量降低,说明ZEB2可以抑制NPC发生凋亡；sFRP1表达水平上调,β-catenin表达水平下调；在HNE-1中干扰β-catenin后,FoxO1和Bim表达上调,p-FoxO1表达不变,而在6-10B中过表达β-catenin的结果与干扰β-catenin的结果相一致,ZEB2可能通过β-catenin/FoxO1/Bim通路调控鼻咽癌细胞的凋亡；4)药物剂量反应结果显示,在5-8F和SUNE-1中,si-NC和si-ZEB2两个不同处理组之间存在显著性差异(P值均<0.001)；Dunnett T3多重比较结果显示：5-8F和SUNE-1的不同处理组的细胞存活能力均随药物浓度的增加而减弱(P值均小于0.001),两独立样本t检验结果显示将ZEB2表达下调后,细胞对于DDP的敏感性在10-6M、10-5M较对照组减弱,IC50较对照组降低(P值均<0.001)。分组与药物剂量之间存在交互作用,即说明两组的细胞存活力随药物剂量的增加而发生变化。MTT检测药物剂量反应的结果提示：下调ZEB2的表达后,5-8F和SUNE-1对DDP更敏感,IC50降低。4.ZEB2促进鼻咽癌细胞发生EMT及其分子机制1) Transwell体外迁移实验显示,干扰ZEB2后,5-8F和SUNE-1的穿膜细胞数减少(p值均小于0.001)；Boyden体外侵袭实验结果显示,下调ZEB2的表达后,5-8F和SUNE-1的穿膜细胞数减少,(p=0.003和p<0.001)；体外运动侵袭实验表明ZEB2可以促进鼻咽癌细胞的侵袭转移；2) Western Blot ZEB2表达下调后,E-Ca表达上调,N-Ca, MMP-2, Snail, Vimentin皆下调,说明ZEB2诱导鼻咽癌发生EMT；利用siRNA干扰技术下调β-catenin的表达后,western blot结果显示E-Ca上调,N-Ca, Vimentin, Snail表达下调；利用Bio过表达P-catenin的western blot结果与干扰β-catenin的结果相一致；表明ZEB2也可能通过激活经典的Wnt/β-catenin通路促进EMT。5.ZEB2参与维持肿瘤干细胞的“干性”1)无血清培基中培养肿瘤球,提取肿瘤球的蛋白进行Western Blot检测,结果显示Nanog、OCT-4、β-catenin、ZEB2在肿瘤内的表达含量较贴壁的细胞增高；2)下调ZEB2的表达后,Western blot验证干性相关蛋白的变化。结果显示：Nanog, SOX-2, OCT-4的表达下调,提示ZEB2可能参与维持NPC的干性；3)下调ZEB2的表达后,SP比例下调(P值分别为0.003和0.025)；4)下调P-catenin的表达后,OCT-4, Nanog, SOX-2的表达下调,过表达β-catenin的结果与干扰的结果相一致,提示ZEB2可能通过激活经典Wnt/β-catenin通路参与维持肿瘤干细胞的“干性”；5)下调ZEB2后,进行microRNAs芯片检测,miR-200a, miR-200b, miR-200c,miR-203表达升高,Q-PC验证；6) Q-PCR检测5-8F和SUNE-1两株细胞的肿瘤球和贴壁细胞中ZEB2和miR-203的表达量,结果显示ZEB2在肿瘤球中的表达量高于贴壁细胞(P值分别为0.004和0.007)；miR-203在肿瘤球中的表达量低于贴壁细胞。(P值分别为0.001和0.002),说明ZEB2有可能通过下调miR-203的表达量,参与维持肿瘤干细胞的“干性”。结论ZEB2在鼻咽癌组织中系高表达,并与肿瘤的临床分期、脉管浸润呈正相关。下调鼻咽癌细胞5-8F、SUNE-1中ZEB2的表达后,细胞周期由G1期进入S期,说明ZEB2使细胞阻滞于G1期,抑制细胞的增殖；干扰ZEB2后,处于凋亡早期的细胞的比例增高,说明ZEB2可以抑制鼻咽癌细胞发生凋亡,可能是通过β-catenin/FOXO1/Bim通路抑制凋亡；同时,ZEB2促进鼻咽癌细胞发生EMT并参与维持肿瘤干细胞的“干性”。以上结果提示,ZEB2在鼻咽癌中抑制增殖、抑制凋亡、促进EMT并参与维持干性,与鼻咽癌的发生、发展密切相关。