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自噬机制是近年来发现的继凋亡之后细胞程序性死亡的新机制。自噬机制与胚胎发育、个体生长、代谢和死亡等生命历程密切相关,自噬的主要功能为降解细胞长寿命蛋白和异常聚集蛋白。神经元内蛋白多为长寿命蛋白质,降解需要自噬途径参与,但自噬基因与胚胎神经系统发育的关系仍不清楚。此外,神经变性疾病多是以变性蛋白异常聚集为特征,如帕金森病病理机制是α-synuclein、PINK1等蛋白异常聚集形成Lewy小体。很多综述文献报道自噬途径与帕金森等神经变性疾病有重要联系,自噬途径受阻引起蛋白不能降解而异常聚集,进而诱发各种神经变性疾病。也有文献报道促进自噬途径可能改善神经变性疾病症状。但这些报道多数为综述性文献,自噬途径在神经退行性疾病中的作用机制也仍不清楚。本研究以斑马鱼为实验动物,在基因/蛋白水平、细胞水平和表型/个体行为三个层次分别研究了自噬基因atg5及相关基因在胚胎神经发育中的作用和在MPTP诱导的帕金森样神经退行性病变中的作用,探讨了雷帕霉素与MPTP的相互作用及对atg5基因活性的影响。主要研究结果如下:
一、自噬基因atg5在斑马鱼胚神经发育中具有重要的调控作用
通过自噬基因atg5的时空表达规律和基因功能分析,发现atg5基因的表达水平伴随着胚神经系统的发生和发育的变化而变化;通过下调或上调atg5基因的表达水平,发现atg5是脑区和躯干形态发生过程的必需因子,同时atg5也可以调控神经元marker基因gli1,huC,nkx2.2,pink1,β-synuclein,xb51和zicⅠ表达。研究进一步发现atg5是斑马鱼自噬途径中的一个关键基因,可以调控其他自噬基因atg3、beclin1等的转录,并影响自噬标识LC3-Ⅱ/LC3I比值的变化。此外,一个重要发现是ATG5蛋白可能通过一种反馈抑制环的方式调控自身基因的转录。同时发现另一个自噬基因atg12可能是一个看家基因,且一直处于恒定的高水平表达,提示ATG5-ATG12泛素结合系统的形成可能主要依赖ATG5蛋白水平调节,而非依赖ATG12蛋白。综上,atg5基因及自噬途径参与调控了斑马鱼神经系统的发生和器官发育。
二、自噬途径在MPTP诱导/RAPA抑制的斑马鱼帕金森样模型中的作用
采用可导致人帕金森疾病的化合物MPTP和自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)分别或共同作用于斑马鱼胚胎/幼体,研究自噬途径在以帕金森病为代表的神经变性疾病中的作用。
首先根据MPTP诱导的斑马鱼幼体神经胚发育畸形、导致中后脑神经元细胞丢失、行为学缺陷、多巴胺神经元标志基因th转录水平的下调等指标初步建立了斑马鱼幼鱼帕金森模型。通过基因表达检测发现MPTP能导致斑马鱼和入神经母细胞瘤细胞atg5表达水平下调,推测可能部分阻断自噬通路。而自噬促进剂RAPA可以导致斑马鱼幼体处于兴奋状态,诱导atg5、beclin1等自噬基因表达上调,同时影响神经系统发育基因huC、xb51、zic1、β-synuclein转录水平,提示RAPA可作用于神经系统。进一步研究发现RAPA对MPTP导致的帕金森模型的神经毒性具有挽救作用,但这种挽救作用是暂时的,两者主要作用为协同毒性:表现为高剂量的两种化合物共同作用于斑马鱼胚胎,畸形更加严重、死亡率/畸形率大于同剂量的两种化合物单独作用之和。本研究进一步对这种挽救作用和协同毒性机制进行了初步探讨,发现RAPA和MPTP具有许多共同的靶蛋白,诱导或者抑制蛋白的作用多数一致,这可能是导致协同作用的原因;但MPTP可抑制一种34.4kD蛋白的表达,RAPA则与之相反,推测这可能是RAPA能暂时挽救MPTP毒性的原因。
本文研究了自噬基因atg5在斑马鱼胚胎神经发育中重要调控作用和RAPA对MPTP诱导的斑马鱼帕金森模型的挽救及两者的协同作用,为深入研究自噬途径在胚神经发育和神经变性疾病中的作用提供信息,并为探索神经退行性疾病的机制和潜在的治疗方案提供了基础性数据和依据。