阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是引起老年人痴呆的最常见原因之一。作为一个严重的公共卫生问题,AD已经影响着全球几千万人的身体健康和生活质量。AD以认知功能逐渐下降为主要表现,其病理特征之一是脑内出现大量、高密度的老年斑。老年斑主要沉积在与学习记忆功能有关的大脑皮层和海马等部位。老年斑中主要的神经毒性成分是由39-43个氨基酸组成的β淀粉样蛋白(Amyloid β-protein,Aβ),其与AD患者认知功能的下降密切相关。全长Aβ片段的神经毒性作用已有在体和离体实验的广泛报道,但Aβ神经毒性作用的活性中心和作用机制仍存在很大争议,同时目前也缺乏有效对抗Aβ的神经保护性药物和措施。大量实验证明,Aβ25-35是全长Aβ分子中一个较短的活性片段。本研究室在以往的研究中发现,另一个由5个氨基酸组成的短肽Aβ31-35也能在细胞培养、离体膜片针钳和在体电生理实验中表现出与Aβ25-35类似的神经毒性作用。这些研究提示：31-35序列可能是Aβ分子一个更短的活性片段。然而,Aβ31-35是否在行为学上也能影响大鼠的学习记忆功能尚未见报道.Humanin(HN)是由日本学者Hashimoto等对一位AD患者枕叶cDNA进行功能检测时发现的一个线性多肽。HN及其强效衍生物[Gly14]一Humanin(HNG)的发现为AD和其它记忆损伤疾病的治疗开辟了一条新的道路。HN可有效保护神经元免于多种AD相关损伤如神经毒性Aβ蛋白引起的细胞死亡。并且,在已报道的抗Aβ神经毒性的神经保护因子中,HN是唯一一种既能抑制Aβ神经毒、又能抑制各种家族性AD基因突变和APP抗体诱发的神经毒性作用的短肽。我们最近的在体实验也表明,HNG可以保护大鼠在体海马CA1区LTP免受Aβ引起的损伤。然而,HNG神经保护作用的分子机制迄今为止仍不十分清楚。因此,本实验利用行为学和Real time PCR分子生物学实验手段,采用双侧海马分别或者联合注射Aβ31-35和NNG的方法,观察探讨了HNG对抗Aβ31-35伤害大鼠空间学习记忆功能的保护作用及其可能的信号转导机制,旨在为AD的预防和治疗提供可能的新思路。实验具体分为以下两部分：第一部分：HNG拮抗Aβ31-35引起的大鼠空间学习记忆伤害目的：本实验通过使用Morris水迷宫方法探讨HNG对抗Aβ所致大鼠空间学习、记忆功能伤害的神经保护作用。方法：实验取运动灵活、无视力障碍的成年雄性SD大鼠(220-250g),随机分为对照组、不同浓度Aβ31-35组、HNG组、不同浓度HNG+Aβ31-35组以及Genistein+HNG+AB31-35组,每组10只。在脑立体定位仪引导下,用微量注射器将药物或生理盐水缓慢注入双侧海马CA1区。术后2周行Morris水迷宫定位航行和空间探索实验,分别测定大鼠空间定位学习和记忆能力。主要指标包括：大鼠寻找平台的平均逃避潜伏期和游过距离、撤除平台后大鼠在目标象限游泳时间和游过距离占游泳总时间或总距离的百分比。同时,测定各组大鼠的游泳速度和视力,以除外运动和视力障碍对测定指标的影响。结果：(1)对照组大鼠逃避潜伏期在训练的第1、2、3、4、5天分别为86.9±5.2s,40.3±3.8s,24.5±2.1s,21.2±1.5s和18.4±1.2s；大鼠找到平台所游过距离分别为1855.5±133.5cm,645.4±95.1cm,413.1±60.7cm,296.13±35.2cm和218.6±36.0cm；撤除平台后动物在目标象限所花时间占游泳总时间的百分比为49.4±1.2%；目标象限内游过距离占总距离的百分比为47.8±1.6%。(2)双侧海马注射不同浓度Aβ31-35(2.0nmol,10.0nmol,20.0nmol)显著降低了大鼠的空间学习和记忆能力,与对照组相比,平均逃避潜伏期和游泳距离两个指标在各时间点均明显延长(P<0.05或P<0.01)；在2.0nmol,10.0nmol及20.0nmol Aβ31-35组,撤除平台后动物在目标象限所花时间占游泳总时间的百分比分别减少至38.9±1.2%,35.9±2.6%,30.3±1.5%,游过距离占总距离的百分比也减少至36.0±1.8%,32.6±1.4%,28.0±1.4%,与对照组相比显著缩短(P<0.01)。海马注射Aβ31-35的反序列Aβ35-31对以上学习和记忆功能均无明显影响(P>0.05)。(3)HNG单独给予组大鼠在定位航行试验或空间探索实验中的学习忆功能均无明显改变(P>0.05)；(4)联合给予HNG和Aβ331-35后,不同剂量的HNG对Aβ31-35所致的定向航行和空间探索能力均显示出一定的剂量依赖性保护效应。0.02nmol HNG对Aβ31-35的行为学伤害未表现出明显改善(P>0.05)；而0.2nmol和2.0nmol HNG处理后,平均逃避潜伏期和寻找平台距离明显小于单独使用Aβ31-35组(P<0.05)。空间探索实验则显示：联合给药的0.2nmol和2.0nmol HNG组在目标象限所花时间和游过距离占游泳总时间和距离的百分比较单独使用Aβ31-35组明显增加,0.2nmol组分别为45.2±1.0%和40.9±1.4%(P<0.05)；2.0nmol组分别为48.6±1.2%和46.8±1.6%(P<0.01)。(5)40.0nmol Genistein预处理后,明显减弱了HNG对Aβ31-35诱导的空间学习记忆损伤的保护作用,平均逃避潜伏期(P<0.01)和寻找平台距离(P<0.05)明显大于HNG+Ap31-35组；空间探索实验则显示,40.0nmol Genistein预处理组在目标象限所花时间占总时间的百分比为34.3±1.8%,目标象限所游过的距离占总距离的百分比为32.1±1.3%,与HNG+Aβ31-35组相比均明显减少(P<0.01)。(6)可视平台测试结果显示,与对照组相比,各处理组大鼠游泳速度和视力没有明显区别(P>0.05),表明大鼠的运动功能和视力没有受到所给药物的影响。结论：双侧海马注射Aβ31-35剂量依赖性伤害了大鼠的空间学习与记忆功能,提示31-35序列可能是Aβ分子中一个更短的活性片段。HNG预处理剂量依赖性拮抗了Aβ31-35引起的学习记忆伤害,给予酪氨峻激酶抑制齐Genistein(?)几乎完全逆转HNG的抗Ap效应。提示HNG内神经保护效应机制可能与激活内源性酪氨酸激酶途径有关,HNG上调酪氨酸激酶信号转导对AD患者认知功能的改善具有重要意义。第二部分HNG和Aβ31-35对大鼠海马STAT3和Caspase-3基因表达的影响目的：使用Real time PCR技术检测双侧海马注射Aβ31-35和HNG对大鼠海马组织STAT3和Caspase-3基因表达的影响,以揭示HNG在行为学上对抗Aβ的神经保护效应的可能机制。方法：行为学实验结束后,五组大鼠(对照组、Aβ31-35组、HNG组、HNG+Aβ31-35组以及Genistein+HNG+Ap31-35组)断头处死、取脑,并分离出海马组织进行超声匀浆、提取总RNA、逆转录为cDNA、然后采用Real time PCR以GAPDH为内参检测海马组织中STAT3和Caspase-3的mRNA相对表达量。结果：(1)对照纠大鼠海马组织中1STAT3和Caspase-3的mRNA相对含量为0.99±0.02和0.99±0.03。(2)与对照组相比,给予2.0nmol Ap31-35后大鼠海马组织中STAT3的基因表达量明显下降(0.74±0.05,P<0.01),而Caspase-3的基因表达量明显上升(1.25±0.06,P<0.01)。(3)双侧海马注射2.0nmol HNG上调大鼠海马组织中STAT3mRNA的表达,STAT3mRNA相对水平为1.23±0.07,明显高于对照组(P<0.01)；而海马组织中Caspase-3的mRNA相对表达下降至0.69±0.05,明显低于对照组(P<0.01)。(4)HNG和Aβ31-35合用后有效逆转了Aβ31-35引起的大鼠海马基因表达的改变,STAT3和Caspase-3的mRNA相对表达量为1.11±0.05和0.64±0.05(P<0.01)；但Genistein预处理后几乎完全抑制HNG拮抗Aβ的神经保护效应,STAT3和Caspase-3的mRNA相对表达量为0.65±0.06和1.28±0.0(P<0.01)。结论：Aβ通过激活Caspase-3依赖的细胞内凋亡途径和压抑STAT3的基因表达诱导大鼠行为学损伤；HNG通过上调STAT3的转录调节,同时阻Caspase-3依赖的细胞内凋亡途径发挥拮抗Aβ诱导的大鼠学习记忆伤害神经毒性作用。提示：HNG拮抗Aβ331-35诱导的神经毒性作用机制可能与激活内源性酪氨酸激酶途径有关,HNG上调酪氨酸酶信号转导并抑制细胞凋亡可保护AD患者免受Aβ引起的认知功能伤害。