论文部分内容阅读
确定调控人类肿瘤转移关键基因对发现肿瘤治疗新策略具有重要意义。肿瘤转移过程中存在多种调控因素,它们在不同类型肿瘤中发挥着不同的作用,有的在肿瘤转移中的作用还存在争议,也有一些调控因子被逐渐揭示在肿瘤转移过程中发挥作用。PAR-1是凝血酶的主要受体,是近来发现的可能与肿瘤转移相关的基因。虽然已对PAR-1与肿瘤转移的相关性进行了初步研究,但对其在肿瘤增殖和转移过程中的作用尚未阐明。对PAR-1功能的研究多数是以细胞系为模型的体外实验,对其在人体标本中的实验研究却很少,PAR-1与人类肺癌转移相关性的研究尚未见报告。我们首先以人体肺癌组织和细胞株为研究对象,通过体内及体外实验研究,探讨PAR-1在人类肺癌侵袭、转移过程中的作用及调节的分子机制。 用RT-PCR及免疫组化方法观察PAR-1在人类肺癌组织中的表达。比较肺癌原发灶及部分转移灶中PAR-1的表达情况,结合临床病理资料及形态学定量分析结果,探讨PAR-1表达与肺癌侵袭、转移的关系。结果显示:转移组与非转移组、原发灶与转移灶、以及原发灶与肺组织之间的PAR-1表达存在显著差异;而在肿瘤大小、组织学类型和组织学分化的各组之间差异无显著意义。以上结果提示了PAR-1过度表达与人类肺癌侵袭和转移的相关性。 RT-PCR、Western blot方法检测5个不同类型肺癌细胞株中PAR-1的表达情况,结果显示:PAR-1mRNA和蛋白在肺巨细胞癌细胞株PLA801D(高转移潜能)、PLA801C(低转移潜能)、肺腺癌细胞株Anip973(高转移潜能)、AGZY83-a(低转移潜能)以及肺小细胞癌细胞株NCI-H446中均有不同水平的表达,但在PLA801C和PLA801D中的表达差异最明显。将PAR-1正义和反义真核表达载体分别转染至PLA801C和PLA801D细胞中,筛出稳定转染的细胞株为模型。RT-PCR和Western blot及免疫组化检测稳定转染细胞株中PAR-1的表达变化,结果显示:转染正义和反义PAR-1分别明显上调和下调了PLA801C和PLA801D的PAR-1mRNA和蛋白表达水平。构建了PAR-1正、反义稳定转染细胞模型。 通过MTT比色、软琼脂集落形成、流式细胞仪检测细胞周期、细胞-基质粘附、划痕修复、Transwell细胞运动和Transwell细胞侵袭等一系列细胞学功能实验,观察稳定转染细胞株PAR-1的差异表达对肿瘤细胞增殖、粘附、运动和侵袭的影响。结果显示:转染正义PAR-1对细胞的生长和克隆形成具有促进作用;并可明显增强细胞对细胞外基质的粘附和侵袭能力。相反,转染反义PAR-1对细胞摘要模型的生长和克隆形成具有抑制作用;能明显降低细胞的S期和GZ胭期、升高GO/GI期所占比例;还可使细胞对细胞外基质的粘附力和侵袭力明显降低。表明PAR一1能够影响人肺巨细胞癌高、低转移潜能细胞株PLA一80 ID、C的生长和增殖、粘附和侵袭特性。 通过激光共聚焦显微镜检测细胞内c扩十浓度及westem blot检测转移相关蛋白的表达变化,探讨PAR一1参与肺癌转移相关的机制。结果显示,转染正义PAR一1可导致细胞内游离c扩+存储量增加,同时明显增加凝血酶和凝血酶受体激活肤诱发的细胞内c扩+信号上调的速度和幅度;与此相反,转染反义PAR一1可引起细胞内游离c扩十存储量减少,并抑制凝血酶和凝血酶受体激活肤引发的细胞内c扩+信号上调的幅度。结果还发现转染正义PAR.1可上调VEGF和CD44v6、下调P53在细胞模型中的表达水平;而转染反义PAR一1可降低VEGF和CD44v6并增加P53在细胞模型中的表达水平。以上实验从正反两方面说明了PAR一1参与肺癌转移的机制可能是通过调节细胞内c扩十及某些转移相关基因(如vEGF、CD44v6和P53)的功能来实现的。小结:PAR-1过度表达可能与肺癌的侵袭和转移表型有关;队R一1能够影响人肺巨细胞癌细胞株PLA一80 ID和PLA801C的生长、粘附和侵袭等特性;PAR一1可能通过与细胞内的c扩十和某些肿瘤转移相关的分子(如vEGF、cD44v6和P53)的相互作用而参与肺癌的转移过程。PAR一1可能是人类肺癌侵袭和转移过程中发挥重要作用的因素之一。