肿瘤相关巨噬细胞自噬调控对结肠癌细胞侵袭性的影响

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目的:研究肿瘤相关巨噬细胞自噬调控后对三种人结直肠癌细胞侵袭性的影响。方法:使用弗波酯PMA、人重组IL-4激活人单核细胞THP-1分化为M2(Ⅱ-type tumor associated macrophages)后,分别用不同浓度雷帕霉素(Rapamycin)干预其自噬状况,进而采用非接触共培养方式将不同浓度自噬调控剂上调组M2、空白实验组M2分别与HCT116、LOVO、CACO-2人结肠癌细胞共同培养48h。共培养之前采用流式细胞术鉴定选择激活途径激活所得细胞表面CD68、CD204、CD206标志性分子表达情况;应用MDC荧光染色法、免疫荧光检测自噬标记性蛋白LC3观察自噬调控剂作用后各组M2自噬的发生情况;应用transwell小室、细胞划痕方法分别检测各组人结肠癌细胞侵袭、运动能力;采用免疫荧光法观察侵袭相关蛋白E-cadherin、Vimentin、P53、NM23-h1在各组人结肠癌细胞中的表达情况;最后应用半定量RT-PCR、Western Blot技术分别对各组人结肠癌细胞侵袭相关基因及蛋白进行检测。结果:人单核细胞白血病细胞THP-1在通过PMA/PMA、人重组IL-4依次序贯作用总计72h小时后,检测所得2种贴壁细胞表面CD68、CD204、CD206的表达水平,流式细胞检测结果表现为经上述2种药物作用后所得的细胞表面CD68、CD204、CD206表达皆不仅高于未经处理的THP-1细胞,也高于只经PMA作用所得的细胞,差异具有统计学意义(P<0.05)。针对M2自噬水平的LC3免疫荧光及自噬囊泡MDC荧光蛋白染色检测结果显示:在经过不同浓度自噬上调控剂作用后的M2自噬标志性蛋白LC3在撤除干预药物48h后仍然显著表达,自噬标志性蛋白LC3荧光表达强度与自噬上调剂浓度呈正相关。细胞划痕、transwell试验结果均提示:自噬上调的M2可对各组人结肠癌细胞迁移、侵袭能力产生抑制效应,与各空白实验组、对照组存在显著差异,差异具有统计学意义(P<0.05)。半定量PCR、Western blot检测结果均提示:自噬上调的M2可对各组人结肠癌细胞迁移、侵袭相关基因及蛋白表达产生抑制效应,与各空白实验组、对照组存在显著差异,且各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:自噬上调的M2对人结直肠癌细胞侵袭迁移相关基因、蛋白表达具有下调作用;自噬上调的M2对人结直肠癌细胞侵袭、迁移能力具有抑制作用。
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