香蕉凝集素BanLec1的原核表达及活性分析

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香蕉凝集素(BanLec)属于木菠萝凝集素(Jacalin)家族中mJRLs(mannosespecificjacalin-related Lectins)亚族的一种凝集素。从结构上来看,香蕉凝集素是由二个相同的亚基构成的同型二聚体蛋白,表现出对甘露糖或葡萄糖特异结合。从功能上来看,香蕉凝集素具有植物凝集素最本质的功能:特异性糖结合活性的功能,这是与其他植物蛋白的标志性差异。其对糖的特异性结合决定了它能够与细胞表面的含糖受体结合,因而能够使游离的单细胞聚集成团产生凝集作用。随着对植物凝集素的功能的深入研究发现,植物凝集素具有很多种生物学功能,如储存营养,防御作用,参与生物固氮等等。因此对植物凝集素的研究不仅仅停留在基础理论研究方面,更多的是向农业应用,医学研究方面发展。据研究发现,香蕉凝集素对HIV的侵染有一定的抑制作用,是因为香蕉凝集素蛋白表面含有糖基特异性结合位点,能够结合艾滋病毒表面糖基化的包膜蛋白gp120,从而阻止HIV对细胞的侵染。本实验通过克隆BanLec1基因,原核表达rBanLec1蛋白并对其糖抑制,稳定性,抑菌性以及能否阻止烟草花叶病毒(TMV)侵染烟草进行分析。  利用生物信息方法分析可知,该BanLec1基因大小为426bp,编码141个氨基酸,蛋白单体分子量大小为15KD。本实验采用成熟的香蕉果肉作为实验材料,利用RT-PCR的方法扩增了香蕉凝集素BanLec1基因,并将BanLec1基因成功的连接到表达载体pETGST上。将重组表达载体pETGST-BanLec1转化大肠杆菌C43菌株,经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达和SDS-PAGE电泳检测。将表达出的可溶性rBanLec1融合蛋白通过Ni柱进行分离纯化。  原核表达的rBanLec1蛋白对狗的红细胞有凝集作用,而对兔的红细胞无凝集作用。切割rBanLec1蛋白的麦芽糖结合蛋白标签(MBP)后,获得的BanLec1蛋白和香蕉的粗提物一样对兔和狗的红细胞具有强烈的凝集作用。糖抑制实验结果显示D-麦芽糖,葡萄糖,D-甘露糖,D-果糖对凝血活性有一定的抑制作用,而蔗糖,D-半乳糖,乳糖对rBanLec1蛋白凝集活性没有抑制作用。这说明rBanLec1蛋白是属于对甘露糖或葡糖糖特异的Jacalin家族凝集素。rBanLec1蛋白在各个温度下处理20分钟,20℃,40℃处理后活性几乎不变,60℃处理后仍保持40%的活性,70℃处理后活性大部分丧失,80℃和90℃处理后,活性完全丧失。在pH小于1.4时,rBanLec1蛋白活性逐渐丧失,pH4~12范围内活性比较稳定。说明rBanLec1蛋白是对热,碱较稳定,强酸下不稳定性的凝集素,这与其他的多数凝集素的性质相似。  rBanLec1蛋白对弧菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,水稻白叶枯病菌,油菜菌核病菌生长没有抑制作用,说明rBanLec1蛋白对细菌和真菌可能没有抑制作用。TMV作为一种常见的植物病毒,只有RNA和蛋白质衣壳组成。我们设计让TMV扣BanLec1蛋白混合物侵染烟草的实验,结果证明BanLec1蛋白能够有效地阻止TMV对烟草的侵染。
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