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卵巢癌是一种初期症状不明显的妇科恶性肿瘤,大多数患者在步入中晚期时才能确诊,因此死亡率较高。近年来随着紫杉醇与铂类药物的联用,卵巢癌的疗效得到改善,但总体五年生存率仍较低,原因主要在于化疗耐药性的产生。化疗耐药的产生过程复杂,其中抑癌基因发挥着重要作用。研究表明,近80%的卵巢癌患者存在p53基因的突变,且p53的表达与其化疗耐药性密切相关,因此,如何将p53基因成功递送至卵巢癌耐药细胞是有效逆转其化疗耐药的关键。另一方面,耐药性通常与药物外排有关。P-gp因其具有药物外排功能近年来备受关注。它依靠细胞内的三磷酸腺苷(ATP)将治疗药物排出到细胞外,增加肿瘤细胞对药物的抗药性。因此,下调P-gp表达,抑制药物外排就可有效降低化疗耐药性,姜黄素(Curcumin,CUR)具有显著抑制P-gp对细胞毒性药物的外排作用。基于以上分析,本课题旨在制备高效低毒的非病毒转基因载体基础上,通过增强p53体内转染效率,并利用CUR抑制药物外排,制备同时递送姜黄素和p53的共递送系统,从而有效提高卵巢癌耐药细胞对顺铂的化疗敏感性,提高卵巢癌的化疗效果。本课题第一章介绍了卵巢癌的耐药机制、聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)作为转基因载体存在的缺陷和基于PEI为主体的共载药系统的构建。本课题第二章讲述了CUR-PEI-K14的合成与表征。首先采用固相法合成双功能肽K14(C-t Lyp-1-NLS-C)和CPLGLAG肽,并通过电喷雾质谱分析鉴定序列,运用HPLC测定纯度。然后,采用K14交联低分子量PEI,得到新型非病毒基因载体PEI-K14,通过酸胺反应制备姜黄素中间体CUR-CPLGLAG,并通过CPLGLAG肽将姜黄素接枝到PEI-K14表面,得到CUR-PEI-K14聚合物,并通过~1H-NMR进行结构分析。结果表明,成功合成了双功能肽K14和CPLGLAG肽,纯度均达到97%,~1H-NMR结构表征结果显示CUR-PEI-K14已成功合成,表明合成方法稳定、可控。本课题第三章评价了CUR-PEI-K14的理化性质。采用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)观察CUR-PEI-K14和CUR-PEI-K14/DNA的形态,运用DLS对其粒径和表面电位进行测定,通过1%的琼脂糖凝胶电泳评价CUR-PEI-K14的DNA包合能力、抗血清及抗肝素钠的解离能力,并通过酸碱滴定法评价其缓冲能力。结果表明,CUR-PEI-K14/DNA复合物体系分散均匀,呈类球形,粒径、电位适中,在20-150nm、18-37m V之间,适宜在体内运输;在质量比为0.8时,DNA所带电荷被聚合物完全中和,表明CUR-PEI-K14具有较强的DNA包合能力;通过对其体液稳定性评估发现,CUR-PEI-K14/DNA在含25%血清、1200μg/m L肝素钠的溶液中能稳定存在,表明CUR-PEI-K14/DNA系统具有良好的抗体液解离能力;同时,CUR-PEI-K14具有良好的p H缓冲能力,表明CUR-PEI-K14/DNA系统具有良好的质子海绵效应,这些理化特性展示了CUR-PEI-K14具有在体内高效递送p53与CUR的潜力。本课题第四章探讨了CUR-PEI-K14/p53对SKOV3-DDP细胞株化疗增敏作用。首先选用PEI 2 k Da、PEI 25 k Da为对照,以p EGFP-N2绿色荧光蛋白质粒和p GL3-Control虫荧光素酶质粒为报告基因,定性、定量考察CUR-PEI-K14对SKOV3-DDP细胞的转染能力。结果表明在SKOV3-DDP细胞中,由于PEI 25 k Da的毒性过大,其转染效率低于PEI 2 k Da。另外,与PEI 2 k Da相比,CUR-PEI-K14/DNA的转染效率呈现明显优势,K14的修饰显著提升了复合物的转染效率。其中CUR-PEI-K14-3转染效果最佳,接近1×10~8 RLU/mg protein,为高效运送p53基因提供了可行性。对细胞毒性评价结果表明,相比于PEI 25 k Da,在相同浓度下,CUR-PEI-K14的毒性远低于PEI 25 KDa,在低浓度时几乎检测不到,显示出良好的生物安全性,适宜进行体内基因递送。然而当其与顺铂联用后则展示了另外一种结果。采用CUR-PEI-K14/p53和顺铂联用对SKOV3-DDP的细胞抑制率实验表明,CUR-PEI-K14/p53显著提高了SKOV3-DDP细胞对顺铂的敏感度。进而,将顺铂、姜黄素、p53以及联合用药作用于SKOV3-DDP细胞探究p53和姜黄素之间的协同作用,结果表明,姜黄素与p53单独用药对SKOV3-DDP细胞生长有一定抑制作用,但效果有限,均不及10μg/m L顺铂单药(抑制率49.76%),在联合处理组中,姜黄素、p53和顺铂(CUR-PEI-K14/p53+DDP)联合处理后SKOV3-DDP细胞抑制率达到最高,约为79.76%,明显增加了顺铂对耐药细胞的抑制作用,表明CUR与p53具有协同增强SKOV3-DDP细胞对顺铂的敏感性的作用。最后,通过QPCR实验,进一步验证了CUR-PEI-K14/p53通过增强p53基因转染,抑制P-gp蛋白的功能,上调促使凋亡基因bax表达,从调控p53基因、药物泵出途径和诱导凋亡途径协同增强卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。本课题针对卵巢癌化疗耐药的分子靶点,构建了同载CUR和p53的新型共载药系统CUR-PEI-K14/p53,将基因药物与天然药物有机结合,联用多种增敏手段,发挥协同作用,为解决目前卵巢癌的化疗耐药性问题及其实际应用探索一条有效途径。