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血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide，VIP)由Said及Mutt于1970年从猪小肠中分离出来的一种为28个氨基酸的多肽，其主要活性成分为VIP7-28，具高度同源性，因有扩张血管及降低血压的作用而命名为血管活性肠肽。近年来，VIP在免疫系统中的发现，使得对它生理作用的认识又进一步深入。研究表明，血管活性肠肽(VIP)有抗炎和调节免疫效应的功能，在急、慢性炎症和自身免疫疾病的治疗上取得显著的疗效，具有潜在的临床应用前景。 已有研究表明在类风湿性关节炎的动物模型上发现VIP显著缓解和防治实验性关节炎，输注VIP可望成为治疗类风湿性关节炎的目前最为有效的治疗手段；VIP和VIP类似物将被证明在治疗炎症和脓毒血症中的作用，成为控制感染性休克有效的治疗途径；但同时也指出：长期的VIP蛋白治疗可引起胃肠道紊乱和机体免疫力下降，而且体内极易降解。基因治疗可弥补VIP蛋白治疗的缺陷，目前国内外未见有此类报道。 越来越多研究表明在细胞或局部组织内的基因治疗将是未来有效治疗自身免疫疾病和炎症的策略和方向。国外学者利用IL-1受体拮抗剂基因来治疗RA，先后在动物实验和Ⅰ期临床试验中取得了满意的结果。为此，我们构建了真核表达质粒pcDNA3.1-VIP，并在体外对表达的VIP活性进行了研究，为下一步的动物实验和临床试验研究打下了坚实基础。 方法 1．目的基因的获得：用TRIzol液提取小鼠胸腺淋巴细胞的总RNA，逆转录得到cDNA，设计一对引物(含Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ酶切位点及信号肽序列)，行PCR扩增反应产生编码28肽的VIP-28 DNA，回收纯化PCR产物。 2．真核表达质粒的构建：分别回收、纯化经双酶切切下的VIP-28 DNA和 晰忆乙J吮月卜闷叹d匕学位论文真核表达质粒PcDNA3.1片断:回收产物连接构建真核表达质粒peDNA3.l一VIP;酶切并测序鉴定真核表达质粒。 3.真核表达质粒peDNA3.l一VIP的瞬时表达:用脂质体将真核表达质粒PcDNA3.1一vIP转染cos一7细胞，48h后心收集细胞及上清液，超声裂解细胞，低温高速离心，得到上清及细胞提取液。ELISA和认化StemBlot鉴定表达蛋白。 4.真核表达蛋白VIP的生物学活性鉴定:将含表达蛋白V于的上清液加入LPS刺激下的巨噬细胞培养液中，观察剂量依赖的TNFQ释放抑制效应;加入VIP中和抗体，观察TNFQ释放抑制效应是否消失。 结果 从小鼠胸腺淋巴细胞中提取到VIP mRNA，经Rl，一PCR扩增，得到预期的约160bp的vIP一28 DNA产物，同时与空质粒peDNA3.1双酶切后连接，构建了含viP一28 DNA的真核表达质粒peDNA3.1一vIP。酶切及测序鉴定表明:插入片段为带有信号肤的VIP一28序列，经翻译后的28个氨基酸顺序完全一致。 经脂质体转染COS一7细胞48h后，分离上清和超声破碎细胞，ELISA和W七sternBlot分析表明细胞提取液及上清液中存在VIP一28蛋白(分子量约为3.3Kda)，同时表明可在细胞外液中分泌表达。 经peDNA3 .1一v伊转染的Cos一7细胞上清能显著抑制MO经LPS诱导的TNF一a的产生，且呈剂量依赖性，表明该重组质粒的表达产物具有生物学活性:VIP的中和抗体能中和上述抑制效应。 结论 1.成功构建真核表达质粒peDNA3.1一VIP。 2.表达的V护具有良好的生物学活性。 3.初步摸索并建立了构建真核表达质粒peDNA3.1一vIP的一套实验方法，为进一步开展V理基因治疗奠定了基础。