论文部分内容阅读
目的:探讨方剂槲芪散(HQS)干预大鼠肝癌前病变形成以及HQS及其君药槲寄生提取物多糖和总碱对人肝癌细胞SMMC-7721生长影响的机制。
方法:体内实验将大鼠分为模型组、HQS大剂量治疗组[8g/(kg·d)]、HQS小剂量治疗组[4g/(kg·d)]、HQS预防组[8g/(kg·d)]、单纯肝大部分切除组及正常组。运用二乙基亚硝胺(DEN)及2-7酰氨基芴(2-AAF)二步法造成Solt-Farber大鼠肝癌前病变模型,采用组织化学方法检测肝脏组织中γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTase)活性的表达;免疫组织化学方法检测肝脏组织中c-jun,c-fos和c-myc基因蛋白的表达。体外实验采用MTT比色法测定HQS及其君药槲寄生提取物多糖、总碱对SMMC-7721细胞增殖的影响:将传代培养的SMMC-7721细胞分别与HQS(0.3125g/L,0.625g/L,1.25g/L),槲寄生多糖(0.625g/L,1.25g/L,2.5g/L,5g/L)及槲寄生总碱(3g/L,6g/L,12g/L)共同培养48h,72h及96h后,测定细胞增殖;采用流式细胞仪分析细胞周期、细胞凋亡;利用激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子(Ca2+)及活性氧(ROS)浓度;采用Quantitative TelomeraseDetection Kit(QTD Kit)测定细胞端粒酶的活性。
结果:体内实验结果显示:大鼠无论在暴露于DEN前一周开始给予HQS预防,还是在暴露于DEN四周后给予HQS[8g/(kg·d)或4g/(kg·d)]治疗,肝脏中γ-GT阳性灶数目及面积均较模型组明显减少(P<0.05);同时显示治疗组和预防组大鼠肝脏中c-jun,c-fos和c-myc基因蛋白的表达较模型组明显降低(P<0.05)。体外实验MTT结果显示:HQS及槲寄生提取物多糖、总碱有较好的抑制SMMC-7721细胞增殖的作用,呈现出时间-剂量依赖性,高剂量组除了HQS和槲寄生总碱48h时间点外,A值均较对照组明显降低(HQS组72h1.022±0.13vs1.207±0.04 P<0.01:;96h:1.235±0.20 vs1.602±0.05 P<0.01;槲寄生多糖组48h0.570±0.03 vs0.744±0.01 P<0.01;72h:0.803±0.04 vs1.207±0.04 P<0.01;96h:0.860±0.13 vs1.602±0.05 P<0.01;槲寄生总碱组72h0.919±0.14 vs1.233±0.04 P<0.01;96h:0.701±0.07 vs1.819±0.04P<0.01)。流式细胞仪检测发现,SMMC-7721细胞经药物作用72h后,槲寄生多糖组及总碱组G1期细胞比例增加(81.0%,86.9% vs70.0%,P<0.01),G2和S期比例降低(13.1%,5.7%vs16.4%,P<0.01;5.9%,7.4%vs13.5%,P<0.01)。HQS组G1期细胞比例无明显变化,S期比例降低(1.5%vs13.5%,P<0.01),32期比例增加(28.2%vs16.4%,P<0.01),三组均使SMMC-7721细胞凋亡增加(HQS组:14.8%vs6.0%,P<0.01;槲寄生多糖组:11.7%vs6.0%,P<0.01;槲寄生总碱组:6.7%vs6.0%,P<0.05)。激光共聚焦显微镜检测SMMC-7721细胞内游离Ca2+水平时发现,在培养的SMMC-7721细胞中加入不同浓度的HQS、槲寄生多糖和总碱,低浓度时细胞内荧光强度有低幅度增强,高浓度均导致细胞内荧光强度显著增强,并基本维持在一高水平,除槲寄生总碱组有略微下降外,其余两组未见明显下降趋势。在观察三种药物对SMMC-7721细胞内ROS浓度的影响时发现,当荧光强度稳定在一基线时,加入槲寄生总碱,荧光强度陡然增强后又迅速下降到低水平,并维持一段时间,而加入HQS及槲寄生多糖未见此变化。端粒酶活性测定结果显示,HQS(0.3125g/L,0.625g/L,1.25g/L)、槲寄生多糖(1.25g/L,2.5g/L,5g/L)和槲寄生总碱(3g/L,6g/L,12g/L)均能明显降低SMMC-7721细胞端粒酶活性,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
结论:HQS能够抑制肝脏癌前病变组织中γ-GT阳性灶的出现以及c-jun,c-fos和c-myc原癌基因蛋白的过表达,干预DEN导致的肝癌前病变形成。HQS、槲寄生多糖和总碱均能抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖,促进凋亡,且初步认为三者引起细胞内钙超载及端粒酶活性的下降可能是其诱导SMMC-7721细胞凋亡的机制之一,且槲寄生总碱的作用还涉及到细胞内ROS水平的升高。