目前有关丙型肝炎疫苗的研究主要集中在两方面，一是从基础研究着手，研究HCV多肽的体液免疫和细胞免疫位点，寻找高突变区以外的具有保护作用的保守序列；另一方面是采用小动物模型，进行整体HCV免疫保护实验。近年来，这两方面的研究都取得了显著进展，使人们逐渐增加了对成功研制HCV疫苗的信心。 核酸疫苗是将编码目的抗原的基因插入带有必要调控元件的真核表达载体中，免疫时只需把构建好的重组质粒接种于机体，机体细胞就会摄取质粒并表达目的抗原，诱导动物免疫系统对编码序列所表达的蛋白质发生免疫应答。免疫效果较好，在流感病毒、HIV及HBV等许多病毒感染性疾病的预防研究中已取得了肯定的结果。本研究是将核酸疫苗应用到丙型肝炎的研究中，选用一个真核高效表达载体，以EF-1α作为启动子，构建了一种能在体外细胞中稳定表达HCV C蛋白的核酸疫苗，将其免疫小鼠，从体液免疫和细胞免疫的角度观察能否诱导产生较高滴度的抗体以及针对HCV特异性的CTL反应，从而验证研制HCV核酸疫苗的可能性。方法：1．核酸疫菌的构建：PCR法从PQE HCVc191质粒扩增出HCV核心区的cDNA，经双酶切法将其定向插入真核表达载体pEF的SaL I和BamH第四罕医大学硕士论文 中文摘要I位点中，构建可在真核细胞中表达HCV C蛋白的核酸疫苗pEF－HCV，用PCR法和酶切法鉴定所构建的重组质粒。2．转染：用脂质体介导法将 pEF卫CV C重组质粒体外转染 BALB／c小鼠 SPZ／0细胞，用斑点杂交和免疫组化法检测 SPZ／0细胞内 HCV C蛋白的瞬时表达情况和稳定表达情况。3．免疫：根据不同的免疫次数、免疫处理方式将所构建的核酸疫苗接种于BALB七小鼠后腿内侧肌肉中，ELISA法检测免疫小鼠血清抗．HCV C水平。4．体外CTL活性检测：于末次免疫后两周，取出免疫小鼠脾脏，研磨制备效应细胞，用稳定转染 pEF－HCV C重组质粒的 SPZ川细胞作靶细胞，乳酸脱氢酶实验鉴定CTL活力。5．体内 CTL活性检测：在末次兔疫后四周，取经pEF－HCV C重组质粒稳定转染的SP2／0细胞，分多点双胁部皮下注射经核酸疫苗4次兔疫的小鼠，建立荷瘤小鼠模型，观察肿瘤出现时间、肿瘤大小、肿瘤数目、小鼠死亡时间各项指标，并设立对照组进行观察比较。结果：1．经酶切鉴定和 PCR鉴定，表明核酸疫苗的构建正确；将所构建的核酸疫苗转入SP2／0细胞后，可在转染细胞中检测到HCV C蛋白的稳定表达。二．以不同的免疫方式、处理方式免疫BALB／c小鼠，观察到HCV核酸疫苗可以诱导产生针对HCV的体液兔疫应答；早期滴度较低，随后抗体水平呈现上升的趋势；加强免疫可以提高血清中抗体滴度，处理实验组可以刺激产主更高的抗体滴度。 3第四军医大学项士论文 中文摘要3．用定量乳酸脱氢酶（LDH）法测定CTL活力，最适效靶比为150：1，该效靶比下各组 CTL反应平均值：对照组为 16．3％士 8．7％，实验组为 72．7％土 6．sl％，经 t检验两组 CTL活性有显著差别。4．荷瘤小鼠产生的肿瘤，在对照组较实验组出现早，前者肿瘤出现时间为 15士 4天，后者为 23士 6天；对照组肿瘤生长速度快，死亡时肿瘤一般＞3＊m：对照组小鼠存活时间较实验组短，两组的存活时间分别为4O土3天和的土6天，各项观察指标经亡检验均有显著差异。讨论： 我们的研究结果说明构建的丙型肝炎核酸疫苗免疫接种BALB儿小鼠后，能诱导产生针对该表达抗原的体液免疫应答和细胞免疫应答，这种免疫应答随着免疫次数的增加而加强。在观察稳定转染重组质粒的小鼠SP2／0细胞对免疫小鼠成瘤性研究中，发现DNA疫苗可以降低成瘤率，抑制肿瘤生长，延长小鼠存活期和提高小鼠存活率。另外，体外杀伤实验证实，DNA疫苗可以明显提高小鼠脾细胞的HCV特异性CTL杀伤率，具有很强的细胞兔疫原性，可以诱导宿主产生明显的CTLS反应。这些结果证实了DNA疫苗的免疫原性及其对体内病毒感染的预防和治疗作用，为HCV的核酸疫苗研究提供一些基础资料。