蛋白质翻译后修饰在生命的许多生物学过程中发挥着重要的作用,并与人类的多种疾病的发生息息相关。目前已知的蛋白质翻译后修饰有300多种类型。本文主要针对蛋白质翻译后甲基化修饰和磷酸化修饰进行了深入的研究。甲基化和磷酸化同其他类型的翻译后修饰一样,都具有低丰度、化学计量数低和动态范围变化大等特征。因此,利用传统的生物学技术不能对其进行大规模化的深入研究。蛋白质组学的突起,特别是质谱仪灵敏度、速度和自动化的提升,成为了蛋白质翻译后修饰大规模化研究的强有力工具。其中“鸟枪法”蛋白质组学策略更是被广泛地应用于翻译后修饰的研究中。本论文主要通过结合“鸟枪法”质谱技术的手段,针对甲基化的定性和定量,以及磷酸化底物筛选等三个方面进行了研究。第一,通过去除甲基化富集过程中糖基化的干扰,并结合多酶切以及多维分离的手段,本论文研发了一种重现性高、成本低、耗时少的非抗体富集的甲基化方法,DOMAIN(De-glycO-assisted MethylAtion site IdeNtification),可以对样品进行全蛋白质组学的甲基化大规模鉴定。并且可以有效地应用于临床样本的研究中。第二,结合同位素细胞培养技术,应用DOMAIN方法,对精氨酸甲基转移酶3的底物进行了筛查。并结合由于不同同位素核结合能不同产生的微小质量偏差Neucode(neutronencoding)思想,研发了特异性识别精氨酸二甲基化的定性定量方法,CoNeucode。不仅如此,同时还开发了针对Neucode的数据处理软件,可以应用于除甲基化以外的其他Neucode数据分析。第三,利用“鸟枪法”质谱技术,对Ack1磷酸激酶底物进行了初步的研究。从组蛋白到非组蛋白,最后到细胞全蛋白质水平。希望能发现一些新的酪氨酸磷酸激酶调控机制。同时,为一些疾病,特别是癌症等疾病提供新的药物靶点和新的治疗思路。综上所述,应用先进的质谱技术不仅能在大规模范围内研究蛋白质翻译后修饰,而且为发现新的蛋白质翻译后修饰位点以及新的生命过程机制提供了极大的可能性。