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机体器官和组织的pH值一般维持在7.2～7.4。许多免疫相关的病理过程(如急性哮喘、肿瘤、炎症和自身免疫病等)病灶组织局部会出现酸化,从而可能对免疫性疾病的发生产生重要影响。巨噬细胞是机体最重要的免疫细胞之一,其病理生理学意义为：是机体清除病原微生物的第一道防线；可通过细胞间相互作用而调节固有免疫和适应性免疫应答；广泛参与炎症、肿瘤、自身免疫病等免疫相关疾病发生、发展。酸敏感离子通道(acid-sensing ion channel, ASIC)属上皮钠通道/退化蛋白(epithelial sodium channel/degenerin, ENaC/DEC)家族成员,是H+门控的离子通道。目前已知,ASIC主要表达于中枢神经系统和外周神经元,参与痛、触、味觉的形成以及学习记忆。近期文献报道,T细胞、破骨细胞、平滑肌细胞和树突状细胞表面也可表达ASIC。本课题主要探讨微环境酸化对小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derive macrophage, BMM)功能的影响,以及此作用与ASIC的相关性。一、微环境酸化对BMM功能的影响1.微环境酸化促进BMM内吞功能：(1)微环境酸化促进BMM吞饮葡聚糖：在酸性环境(pH 6.5)和生理环境(pH 7.3)下,使用FITC标记的葡聚糖检测BMM吞饮功能。结果发现：BMM吞饮能力与FITC-葡聚糖浓度呈正相关,且酸性环境(pH6.5)可增强BMM吞饮作用。应用FITC-葡聚糖(1000μg/ml)分析时间梯度,结果显示：FITC-葡聚糖在BMM内聚集呈时间依赖性,共孵育30 min后酸化组(pH 6.5)与生理组(pH 7.3)出现统计学差异(n=6, P<0.05)。提示：微环境酸化促进BMM吞饮FITC-葡聚糖。(2)微环境酸化促进BMM内吞IgG包被乳胶颗粒：BMM内吞葡聚糖主要依赖吞饮形式而实现,故本课题应用IgG包被乳胶颗粒进一步观察微环境酸化对IgG所介导内吞的影响。结果显示：BMM与IgG包被乳胶颗粒共孵育5 min,酸化组(pH 6.5)多数BMM内吞6个以上颗粒,生理组(pH 7.3)多数BMM仅内吞0～2个颗粒,且酸化组(pH 6.5)比生理组(pH 7.3)的吞噬指数高55.8%(n=6,P<0.05)。以上结果提示：微环境酸化可增强BMM调理内吞功能。2.微环境酸化促进BMM表面CD80、CD86、MHC 11分子表达将生理状态下(pH 7.3,5% CO2)诱导分化的BMM置于酸化环境(pH 6.5培养基)培养3 h(37℃,7% CO2),流式细胞术检测结果显示：微环境酸化可上调BMM表面CD80、CD86、MHCⅡ表达。3.微环境酸化促进BMM分泌IL-10,但对BMM分泌TNF-a无影响BMM分别在生理环境(pH 7.3,5% CO2)和酸化环境(pH 6.5,7% CO2)培养3h,采集培养上清,离心去除细胞碎片,-80℃保存,分别检测IL-10和TNF-α水平。结果显示：酸化环境可刺激BMM分泌IL-10,但对TNF-α分泌无影响。二、微环境酸化调控BMM功能与ASIC相关1.BMM表达ASIC采集诱导分化的BMM,提取细胞总RNA和总蛋白,借助RT-PCR和Western blot分别检测ASIC mRNA和蛋白表达；借助细胞免疫荧光技术检测BMM内ASIC分布。结果显示：ASIC1和ASIC3主要表达于BMM胞质中,BMM不表达ASIC2。2.微环境酸化促进BMM吞饮葡聚糖与ASIC相关应用ASIC阻断剂阿米洛利(amiloride,100μM)探讨ASIC是否参与微环境酸化促进BMM吞饮葡聚糖的作用,结果发现：在pH 7.3培养基中,阿米洛利预处理BMM30 min,其对生理组BMM(pH 7.3)吞饮FITC-葡聚糖无影响(n=6,P>0.05)；而阿米洛利预处理可明显抑制酸化组(pH 6.5)BMM吞饮作用(n=6,P<0.05)。提示：微环境酸化上调BMM吞饮功能与ASIC相关。3.微环境酸化上调BMM相关膜分子的表达与ASIC相关应用阿米洛利(100μM),探讨微环境酸化上调BMM膜分子表达与ASIC的相关性。生理组(pH 7.3)用阿米洛利预处理BMM 30 min(37℃,5% CO2),然后换用pH6.5的培养基培养3 h(37℃,7% CO2),通过流式细胞术检测CD80、CD86、MHC 11分子表达。结果显示：酸化阻断组(pH 6.5+阿米洛利)与单纯酸化组(pH 6.5)组相比,上述膜分子表达明显下调(n=6,P<0.05),而与生理组(pH 7.3)无显著差异(n=6, P>0.05)。提示：微环境酸化上调BMM膜分子表达的作用与ASIC相关。4.非甾体抗炎药可抑制微环境酸化对BMM膜分子表达的上调文献报道,非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID)可抑制多种神经元ASIC电流。本研究应用NSAID分析BMM表面ASIC的功能。应用布洛芬(ibuprofen,200μM)或双氯芬酸(diclofenac,200μM)预处理BMM(pH 7.3,5% CO2,30 min),然后酸化组换用pH 6.5的培养基培养3h(37℃,7% CO2),流式细胞术检测CD80、CD86、MHCⅡ表达。结果显示：NSAID预处理后,酸化组BMM膜分子表达明显下调(n=6,P<0.05),而生理组BMM无明显改变(n=6,P>0.05)。提示：微环境酸化上调BMM膜分子表达的作用与ASIC相关。结论1.微环境酸化可促进巨噬细胞的吞噬功能、膜分子表达和分泌IL-10；2.BMM表达ASIC1和ASIC3；3.微环境酸化对BMM功能的调控作用与ASIC相关。