目的:复发转移是三阴性乳腺癌术后患者的主要致死原因,中医药干预预防复发转移、延长生存期、改善生存质量仍是重要的临床课题。对三阴性乳腺癌术后完成辅助治疗或无需辅助治疗的患者,中医以防止复发转移、改善症状和生存质量为治疗目的,临床上以扶正祛邪为治疗原则行中医巩固治疗,辽宁中医药大学附属医院肿瘤科多年来在“形神统一理论”指导下进行恶性肿瘤术后患者的中医药治疗,取得一定成效,本文通过回顾性临床研究,评价形神统一理论指导下长时间规律柴胡龙牡汤治疗对三阴性乳腺癌术后患者生存期、形神损伤的影响,并进一步开展体内外实验研究进行验证,探索柴胡龙牡汤抑制三阴性乳腺癌复发转移的部分作用机制。材料与方法:1.柴胡龙牡汤抑制三阴性乳腺癌术后复发转移的回顾性临床研究采用回顾性临床研究的方法,回顾分析3年随访资料完整的ⅠⅢ期的三阴性乳腺癌术后患者临床资料,所有患者均按美国国立综合癌症网络（NCCN）临床指南经西医常规治疗。以规律中医药治疗为暴露因素,分为高暴露中药治疗、低暴露中药治疗两个组别,高暴露中药治疗组界定为经西医常规治疗,每年口服中药汤剂,加或不加抗肿瘤中成药≥6个月或累积18个月及以上,低暴露中药治疗组为经西医常规治疗,每年口服中药汤剂,加或不加抗肿瘤中成药不满足高暴露条件者。观察两组复发转移部位和复发转移/死亡时间,统计分析中药干预后两组患者的生存预后及相关影响因素、形（肿瘤具体复发转移情况）神（症候积分、功能评分、体重、KPS评分）损伤变化、相关不良反应情况。2.柴胡龙牡汤含药血清抑制三阴性乳腺癌转移的细胞实验研究开展体外实验研究,将SD大鼠随机编号为空白对照组,柴胡龙牡汤低浓度组、中浓度组、高浓度组,制备含药血清,通过CCK-8法检测MDA-MB-231细胞增殖抑制率、Tr ans-well小室实验检测细胞侵袭能力、划痕实验检测细胞迁移能力、Western Blot检测上皮细胞标记物E-cadherin蛋白、间充质细胞标记物Vimentin蛋白及TGF-β/Smad信号通路关键蛋白TGF-β1、Smad3和下游转录因子Snail蛋白表达情况。3.柴胡龙牡汤抑制三阴性乳腺癌转移的动物实验研究开展体内实验研究,将Balb/c裸小鼠随机编号为空白对照组,模型对照组,柴胡龙牡汤低浓度组、中浓度组、高浓度组,除空白对照组,其余各组制备三阴性乳腺癌荷瘤裸鼠模型,观察裸小鼠的一般状态、5分钟自主活动次数、体重、瘤重,通过IHC和Western Blot检测E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、Smad3、Snail蛋白表达情况。结果:1柴胡龙牡汤抑制三阴性乳腺癌术后复发转移的回顾性临床研究1.1一般基线特征共纳入符合标准的病例150例,高暴露组62例,低暴露组88例,其中女性共149例、男性1例,截至末次随访,共出现复发转移27例,死亡7例（均因疾病进展死亡）。对三阴性乳腺癌患者的一般基线特征进行对比,两组患者差异无统计学意义（P＞0.05）,结果有可比性。1.2生存预后⑴两组患者无病生存和总生存情况:高暴露组3年DFS长于低暴露组,且高暴露组较低暴露组3年无病生存率提高16.9%,差异有统计学意义（P＜0.05）;OS结果、总生存率差异趋势,待后续随访跟进观察。⑵影响TNBC术后DFS的相关预后因子:K-M单因素分析结果显示脉管浸润状态、腋窝淋巴结转移状态、中药暴露因素与三阴性乳腺癌患者DFS有关（P＜0.05）,据单因素分析结果,将脉管浸润、腋窝淋巴结转移及中药暴露因素作为自变量带入Cox比例风险多因素回归模型,结果显示三者均为影响三阴性乳腺癌患者DFS的独立因素（P＜0.05）,此外低暴露组患者复发转移风险为高暴露组的3.724倍（95%CI 1.399,9.915）。⑶探究高暴露中药治疗的潜在获益人群:亚组分析研究结果表明,脉管浸润阴性亚组,高暴露组与低暴露组无病生存率为98.0%,77.9%,脉管浸润阳性亚组,两组无病生存率为69.2%,54.5%,腋窝淋巴结未转移亚组,两组无病生存率为97.9%,77.3%,腋窝淋巴结≤3枚亚组,两组无病生存率为75.0%,80.0%,腋窝淋巴结＞3枚亚组,两组无病生存率为66.7%,42.9%,提示脉管浸润阴性、腋窝淋巴结未转移患者可能成为TNBC术后高暴露中药治疗的潜在获益人群,但亚组分析中,脉管浸润阴性和腋窝淋巴结未转移的高暴露组患者均仅有1例出现复发转移,故亚组分析得出潜在获益人群的结果有待进一步大样本数据论证。1.3形神损伤⑴形伤:高暴露中药治疗后平均形伤积分小于低暴露中药治疗（P＜0.05）。⑵神伤:（1）症候积分,组内比较:低暴露组中药治疗后平均症候积分减小（P＜0.05）,高暴露组中药治疗后平均症候积分显著减小（P＜0.001）;组间比较:中药治疗后高暴露组平均症候积分显著小于低暴露组（P＜0.001）。（2）功能领域得分,组内比较:低暴露组中药治疗后情绪功能评分增加（P＜0.05）,高暴露组中药治疗后总体功能评分均明显增加（P＜0.001）;组间比较:中药治疗后高暴露组总体功能评分均大于低暴露组（P＜0.05）。（3）体重,两组患者体重未见明显增长或降低（P＞0.05）。（4）KPS评分,组内比较:低暴露组中药治疗后KPS评分增加（P＜0.05）,高暴露组中药治疗后KPS评分明显增加（P＜0.001）;组间比较:中药治疗后高暴露组KPS评分大于低暴露组（P＜0.05）。1.4不良反应口服中药期间,高暴露组患者不良反应发生率8.1%,低暴露组患者不良反应发生率6.8%,经检验两组差异无统计学意义（P＞0.05）,两组患者不良反应主要表现在胃肠道不适,予调整中药汤剂后,症状可缓解。2柴胡龙牡汤含药血清抑制三阴性乳腺癌转移的细胞实验研究2.1 CCK-8法检测结果相比于空白对照组,同一时间段,随着含药血清浓度上升,细胞增殖抑制率随之升高,不同浓度之间差异有统计学意义（P＜0.001）;此外同一浓度组,随干预时间延伸,细胞增殖抑制率也随之升高,同一浓度组在不同时间段之间差异有统计学意义（P＜0.05）。2.2 Transwell侵袭实验结果相比于空白对照组,随含药血清浓度上升,侵袭细胞数随之减低,不同浓度之间差异有统计学意义（P＜0.05）。2.3划痕实验结果相比空白对照组,同一时间段,随含药血清浓度上升,细胞迁移率逐步降低,但时间在12h和24h时,不同浓度之间差异无统计学意义（P＞0.05）,时间在36h和48h时,不同浓度之见差异有统计学意义（P＜0.05）;同一浓度组,随干预时间延伸,细胞迁移率随之增加,抑制迁移愈合作用减弱,同一浓度组不同时段的差异比较有统计学意义（P＜0.05）。2.4 Western Blot检测E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、Smad3、Snail蛋白表达相比于空白对照组,随柴胡龙牡汤含药血清浓度上升,各组E-cadherin表达量逐步升高（P＜0.05）、Vimentin蛋白表达量逐步降低（P＜0.001）。相比于空白对照组,随柴胡龙牡汤含药血清浓度增加,各组TGF-β1、Smad3、Snail蛋白表达量逐步降低（P＜0.001）。3柴胡龙牡汤抑制三阴性乳腺癌转移的动物实验研究3.1裸鼠一般情况及抑瘤率体内实验中三阴性乳腺癌荷瘤裸鼠造模成功,柴胡龙牡汤能够改善荷瘤裸鼠的一般状态,改善裸鼠自主活动能力（P＜0.05）,减轻裸鼠体重下降幅度（P＜0.05）。柴胡龙牡汤组瘤重均低于模型对照组（P＜0.001）,且随柴胡龙牡汤浓度增加,裸鼠瘤重逐步减低（P＜0.001）,抑瘤率逐步上升（P＜0.001）。3.2瘤组织内E-cadherin、Vimentin表达情况IHC检测结果显示,相比于模型对照组,随柴胡龙牡汤浓度上升,各组E-cadherin平均积分光密度值逐步增大（P＜0.05）、Vimentin平均积分光密度值逐步减小（P＜0.001）,空白对照组乳腺组织E-cadherin、Vimentin无阳性细胞表达。Western blot检测结果显示,相比于模型对照组,随柴胡龙牡汤浓度上升,各组E-cadherin蛋白表达量逐步升高（P＜0.001）、Vimentin蛋白表达量逐步降低（P＜0.001）,空白对照组乳腺组织E-cadherin、Vimentin无阳性表达。3.3瘤组织内TGF-β1、Smad3、Snail表达情况IHC检测结果显示,相比于模型对照组,随柴胡龙牡汤浓度上升,各组TGF-β1、Smad3、Snail平均积分光密度值均逐步减小（P＜0.05）,空白对照组乳腺组织TGF-β1、Smad3、Snail无阳性细胞表达。Western blot检测结果显示:相比于模型对照组,随柴胡龙牡汤浓度增加,各组TGF-β1、Smad3、Snail蛋白表达量均逐步降低（P＜0.001）,空白对照组乳腺组织TGF-β1、Smad3、Snail无阳性表达。结论:1.形神统一理论指导下长时间规律口服柴胡龙牡汤在能够提高三阴性乳腺癌术后及放化疗后患者的3年DFS和无病生存率,本研究中脉管浸润状态、腋窝淋巴结转移状态和中药暴露因素是影响三阴性乳腺癌患者术后无病生存期的独立因素。2.长时间规律口服柴胡龙牡汤在一定程度上能够减轻三阴性乳腺癌患者形神损伤,此外柴胡龙牡汤具有安全性。3.柴胡龙牡汤可能通过下调TGF-β/Smad信号通路关键蛋白TGF-β1、Smad3及下游转录因子Snail表达抑制三阴性乳腺癌的增殖、侵袭迁移和EMT,这可能是柴胡龙牡汤抑制三阴性乳腺癌转移的重要机制之一。4.柴胡龙牡汤能够抑制三阴性乳腺癌瘤组织生长,维持荷瘤裸鼠体重,改善荷瘤裸鼠自主活动及一般状态,在一定程度上减轻荷瘤裸鼠的形神损伤。