脱落酸处理对猕猴桃果实抗冷性的影响及转录因子AchnABF1的功能研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:bluegini2008
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低温贮藏是园艺产品最重要的贮藏方式之一,它能抑制果蔬呼吸代谢、阻止衰败、延长果蔬贮藏期。然而低温引起的园艺产品冷害,是限制采后保鲜产业健康发展的重要因素。‘红阳’(Actinidia chinensis cv.Hongyang)是典型的冷敏感型猕猴桃品种,冷害问题严峻。本研究旨在探索能有效增强‘红阳’果实抗冷性,减轻冷害的处理方式,并探究其作用机制。以‘红阳’猕猴桃为材料,经不同浓度外源脱落酸(ABA)处理后转入冷库贮藏(0℃)。一方面评价不同浓度外源ABA处理对低温贮藏中‘红阳’果实冷害发生的影响,并通过测定木质素合成关键酶的活性及关键基因的转录水平,从生理生化和基因表达层面解析ABA可能发挥的调控作用机制;另一方面通过转录组测序发掘关键的冷响应转录因子家族基因,遗传转化拟南芥和番茄对其功能进行验证,探索冷信号和ABA信号可能的交叉作用。主要研究内容及结果分述如下:(1)经不同浓度ABA预处理后,在冷藏期对‘红阳’果实冷害发生情况进行为期90天的动态监测和评估。研究结果显示:外源ABA在控制‘红阳’果实冷害引起的木质化方面,存在明显的剂量效应。50 mg/L ABA处理显著地上调了木质素合成关键酶基因Ac PAL、Ac CAD和Ac POD的表达水平,并增强了PAL、CAD和POD酶活性,显著地促进了木质素在果皮和果肉组织中的合成和积累,引起果实严重的木质化;而20 mg/L ABA处理则在不同的果实部位表现出不同的调控效应。在果肉组织中显著地下调了Ac PAL、Ac CAD和Ac POD基因的表达,抑制了PAL、CAD和POD酶活性,有效地抑制了果肉组织的木质化,降低了果肉组织中木质素的含量。但在果皮组织中,却表现出刺激木质素积累的现象。通过显微观察发现,‘红阳’冷害引起的木质化先从果皮细胞开始,逐渐向果肉细胞发展。20 mg/L ABA处理促进了木质细胞在果皮部位的形成,从而在果皮形成保护屏障,降低了果实对低温的敏感性,保护了果肉细胞免受低温伤害引起木质化;且该处理减少了果肉组织中直径在40~80μm的木质细胞的数量,防止木质细胞簇的形成,对保护可食部分的品质有积极意义。(2)从‘红阳’猕猴桃基因组中鉴定得到了81个bZIP转录因子家族成员。通过构建系统发育树将81个AcbZIP分为11个亚族,分别对应拟南芥bZIP家族的A-I、K和S亚族。对在冷害温度(0℃)和非冷害温度(2℃)条件下贮藏的猕猴桃果实取样进行RNA-seq测序和转录图谱绘制。根据转录图谱筛选到6个A亚族的成员(AcbZIP12、AcbZIP17、AcbZIP18、AcbZIP31、AcbZIP69和AcbZIP72)拥有不同于其他A亚族成员的motif 17和motif 20蛋白模体,序列高度保守,受到0℃低温诱导。经过与拟南芥ABF/AREB转录因子的蛋白质多重序列比对鉴定,这6个家族成员被鉴定为ABF/AREB转录因子,并命名为AchnABF1~6。经qRT-PCR检测发现AchnABF1~6对外源ABA处理高度响应。其中AchnABF1基因在贮藏期间持续高水平表达,因此后续将重点探究该基因可能的生物学功能。(3)在拟南芥中过表达AchnABF1验证其在低温等非生物胁迫应答中的功能。结果显示:转基因株系在种子萌发期、萌发后期以及幼苗期,均表现出比野生型更强的渗透胁迫(Na Cl、甘露醇等)耐受性和ABA敏感性;低温胁迫条件下,2周大的转基因幼苗表现出比野生型更高的存活率、更少的离子泄漏和丙二醛(MDA)含量,同时AchnABF1基因的过表达还增强了一系列胁迫应答基因(RD29A、COR15A、COR47、KIN1、LTI29、CBF1和CBF2)的表达;多重胁迫处理下(高盐、干旱、低温和复合胁迫),4周大的转基因幼苗表现出良好的抗性表型,且叶片中ROS积累较少、离子泄漏和MDA含量较少、膜脂过氧化减轻。(4)在番茄中过表达AchnABF1验证其在果实抗冷性调控中的功能。通过表型观察、显微细胞结构观察及超微亚细胞结构观察发现,转基因番茄果实比野生型番茄有更强的耐冷表型,表现为水渍化冷害症状减轻;细胞结构相对完整,质膜损伤小,叶绿体破损发生率低,并且叶绿体内淀粉粒变小。同时,转基因番茄果实中淀粉含量显著降低,可溶性糖含量升高,说明AchnABF1基因过表达促进了转基因番茄果实中淀粉向可溶性糖的转化。并且可能是通过提高细胞液浓度,保持细胞渗透势,增强细胞保水性,进而增强了转基因番茄果实的抗冷性。综上,本研究筛选出有效减轻‘红阳’果实冷害的外源ABA浓度,通过转录组分析鉴定出6个受低温响应的ABF/AREB转录因子基因,利用异源转化拟南芥和番茄的方法验证了AchnABF1基因在低温等非生物胁迫中的重要生物学功能,为进一步研究提高猕猴桃果实抗冷性提供重要参考。
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