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结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,而且在我国的发病率总体上呈上升趋势,并且随着人们饮食结构和生活方式的改变,结直肠癌的发病率还会继续上升。尽管近年来对肿瘤研究的不断深入,但肿瘤防控收效甚微；虽然早期诊断尤其是大便潜血检测等方法被应用于健康人群常规筛查,以及不断改进治疗的方法,但进展期结直肠癌的五年生存率仍未得到根本性提高,死亡率也没有明显下降。因此积极开展结直肠癌发病机制研究,寻找新的分子标志物和治疗靶点不仅具有重要的临床价值而且具有重要的社会意义。结直肠癌的发生是一个多基因、多步骤的过程；细胞生长调控紊乱和细胞生长方式的改变引起细胞癌前病变和相关基因的改变,而导致结直肠癌的发生。随着Encode (DNA元件百科全书)计划的系列研究成果的公布,基因组中的“暗物质”非编码RNA逐渐成为研究热点。非编码RNA不仅参与了细胞周期、分化、凋亡和衰老,以及细胞间或细胞内核浆运输等细胞学过程,而且还具有表观遗传学调控、转录调节、转录后及翻译调节、核体亚结构的形成和染色质重塑等重要的分子生物功能。根据转录子的大小可以将非编码RNA粗略分为两类：长度大于200核苷酸的被称作长链非编码RNA,小于200个核苷酸的为小非编码RNA。无论长链非编码RNA还是以microRNA为代表的小非编码RNA,在不同肿瘤及肿瘤的不同阶段具有不同的表达特征,在肿瘤的发生发展及转移过程中也具有重要的作用。本论文研究目的是探讨长链非编码RNA HOTAIRM1和小非编码RNA miR-148a在结直肠癌中表达的意义及其生物学功能。1.长链非编码RNA HOTAIRM1在结直肠癌中的表达及意义我们采用逆转录荧光定量PCR方法检测了109例结直肠癌组织和配对正常结直肠粘膜组织样本中HOTAIRM1的表达,发现HOTAIRM1在结直肠癌中的表达明显低于正常对照组织,而HOTAIRM1的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、部位以及TNM分级等临床病理特征无关。收集150例结直肠癌患者和101例健康对照的血浆标本,将其随机分为训练组和确认组,使用巢氏荧光PCR检测血浆中HOTAIRM1水平。采用logistic回归和ROC曲线分析在训练组中确定诊断结直肠癌的临界值为0.003(CRC≤0.003)；在确认组该临界值诊断结直肠癌的灵敏度为64.00%,特异度为76.50%。与目前常用的肿瘤标志物比较,HOTAIRM1诊断结直肠癌的能力与CEA相似,但高于CA125和CA199；将HOTAIRM1与CEA联合使用诊断结直肠癌灵敏度可以提高到84%,而且结直肠癌患者血浆中HOTAIRM1水平与患者年龄、性别、肿瘤大小、部位以及TNM分级等临床病理特征无关,因此血浆中HOTAIRM1水平下降是结直肠癌独立的诊断指标。2. miR-148a在结直肠癌中的功能研究我们在结直肠癌细胞中过表达miR-148a后发现细胞凋亡明显增加；采用在线软件预测了Bcl-2可能是miR-148a的靶基因。通过荧光素酶基因报告系统和Westernblot证实了miR-148a通过作用Bcl-2的3’-UTR区转录后沉默其表达,同时细胞色素C、caspase9、caspase3和PARP表达增加。另外采用生物软件预测了转录因子MYB可能是miR-148a的上游转录调控因子,使用siRNA干扰结直肠癌细胞中MYB的表达后miR-148a表达升高；通过染色质免疫共沉淀、凝胶迁移实验和荧光素酶报告基因分析等证明了MYB能够识别并结合miR-148a基因组的转录因子结合位点,抑制：niR-148a的转录和表达,而且还证明了MYB通过miR-148a调节Bcl-2表达进一步调控细胞凋亡。我们不仅在体外细胞学水平上证明了Bcl-2是miR-148a转录后抑制的靶基因,在体内裸鼠成瘤试验中也验证了miR-148a抑制Bcl-2表达,在临床水平上发现miR-148a与Bcl-2表达呈负相关,进一步说明miR-148a通过转录后沉默Bcl-2的表达诱导结直肠癌细胞凋亡。综合以上对长链非编码RNA HOTAIRM1和小非编码RNA miR-148a在结直肠癌中的表达和功能研究得出以下结论：(1)长链非编码RNA HOTAIRM1可作为结直肠癌的的诊断指标1)组织中低表达HOTAIRM1可能是结直肠癌组织的一个独立标志物。2)血浆循环细胞游离HOTAIRM1水平下降可以成为结直肠癌诊断的独立分子标志物,与CEA联合能够更准确的诊断结直肠癌。该部分研究在国际上首次报道了血浆中存在细胞游离的长链非编码RNA,而且其循环水平将来可能成为肿瘤诊断的分子标志物。(2) miR-148a促进结直肠癌细胞凋亡1) miR-148a通过靶向抑制其靶基因Bcl-2诱导结直肠癌细胞凋亡。2)转录因子MYB通过识别结合miR-148a基因启动子区域的转录结合位点转录抑制miR-148a的表达。该部分研究阐释了一条新的结直肠癌细胞凋亡信号通路,转录因子MYB转录抑制miR-148a, miR-148a转录后沉默Bcl-2,继而激活线粒体途径释放细胞色素C,持续激活caspase级联反应而进入凋亡程序。