苏云金芽胞杆菌BRC-ZYR2细菌素纯化及串联质谱分析

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:mgy1982
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细菌素(Bacteriocin)是一类由细菌核糖体合成的对产生菌近源或同源的细菌具有抑制或杀灭作用的蛋白质或多肽。细菌素具有热稳定、安全、不改变产品风味、不产生抗药性等优点,在食品、饲料、医药、植物生物防治等领域具有良好的的应用前景。本文研究了苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)BRC-ZYR2产细菌素活性动态,初步测定了细菌素分子量,利用盐析法和色谱层析法分离纯化细菌素,并通过MALDI-TOFMS分析技术初步研究其序列。具体研究结果如下:对BRC-ZYR2产细菌素活性动态进行监测。结果表明,0-24 h处于指数生长期,期间18-24 h对蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus,简称Bc)0938有抑菌活性,抑菌活性在22 h达到最高值,此时菌株处于孢子囊期;26-46h,菌株处于稳定期,期间只有34 h对Bc 0938有抑菌活性;48-72 h,菌株生长处于波动状态,菌量逐渐减少,在此阶段菌液对Bc 0938均无抑菌活性。凝胶原位活性检测初步测定BRC-ZYR2细菌素的分子量。将BRC-ZYR2细菌素跑SDS-PAGE电泳后,进行凝胶原位活性检测,结果显示在略大于10.0 kDa的条带上方出现抑菌圈,则细菌素分子量略大于10.0 kDa。分离纯化BRC-ZYR2细菌素。将2 L BRC-ZYR2发酵培养至抑菌活性最强时(22 h),利用100%饱和硫酸铵沉降细菌素获得粗提液68 mL。细菌素粗提液过葡聚糖G-50 凝胶柱(φ10×600 mm),每次上样 4 mL,用 0.01 mol/LTris-Cl(pH 7.4)进行洗脱,流速为1.0 mL/min。26-40 min出现吸收峰I,64-125 min出现吸收峰Ⅱ,其中吸收峰Ⅱ中78-108 min的洗脱液对有抑菌活性。将活性组分透析、浓缩过纤维素DEAE-52 阴离子交换柱(φ16×300mm),每次上样 4 mL,分别用 0.01 mol/LTris-Cl(pH 7.4)配制的0 mol/L、0.1 mol/L、0.6 mol/L Na溶液进行不连续梯度洗脱,流速为1.0 mL/min。0 mol/L NaCl溶液洗脱时18-40 min出现吸收峰Ⅰ;0.1 mol/L NaCl溶液洗脱时,88-108 min出现吸收峰Ⅱ,110-132 min出现吸收峰Ⅲ;0.6 mol/L NaCl溶液洗脱时,168-207 min出现吸收峰Ⅳ。其中,吸收峰Ⅳ中167-188 min的洗脱液有抑菌活性。将活性组分透析、浓缩后再次过纤维素DEAE-52阴离子交换柱(φ16×300 mm),每次上样4mL,分别用0.01 mol/LTris-Cl(ppH 7.4)配制的0 mol/L、0.15 mol/L、0.3 mol/L、0.6 mol/L NaCl溶液进行不连续梯度洗脱,流速为1.0 mL/min。0 mol/L NaCl溶液洗脱时11-25 min出现吸收峰Ⅰ;0.15 mol/L NaCl溶液洗脱时,60-96 min出现吸收峰Ⅱ,96-105 min出现吸收峰Ⅲ11;0.3 mol/L NaCl溶液洗脱时,128-160 min出现吸收峰Ⅳ;0.6 mol/LNaCl溶液洗脱时,186-196 min出现吸收峰V。其中,吸收峰Ⅱ中64-94 min的洗脱液有抑菌活性。经过透析、浓缩后,共获得活性洗脱液2.5 mL。Tricine-SDS-PAGE检测显示细菌素达到电泳纯;Bradford法测定细菌素浓度为35.6 μg/mL,“琼脂打孔药剂扩散法”测定细菌素活力为235.7 U,回收率为38.8%。BRC-ZYR2 细菌素 MALDI-TOF 检测。将 BRC-ZYR2 细菌素跑 SDS-PAGE 电泳后,切取细菌素条带进行MALDI-TOF检测,获得细菌素一级谱图、二级谱图,Mascot软件在线搜索NCBInr数据库,并未寻找到与之相匹配的蛋白,推测BRC-ZYR2细菌素可能是一种新细菌素。本研究建立了 Bt细菌素的纯化方法,获得Bt BRC-ZYR2细菌素纯品,并显示其可能具有全新的结构。本研究为Bt细菌素规模化生产提供了理论依据。
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