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背景和目的研究显示,人表皮生长因子受体2 (Human epidermal growth factor receptor,HER2或c-erbB-2)扩增或过表达的乳腺癌患者复发转移早,无病生存期短,预后效果差,是乳腺癌十分重要的疾病预测因子和靶向治疗位点,对指导治疗和预后评估意义重大,因此,准确评估乳腺癌患者的HER2状态至关重要。目前,检测HER2的主要方法包括免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC),荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)和色素原位杂交(chromogenic in situhybridization,CISH),组织PCR检测方法等。但组织学检测需取得病理标本,对未取得或无法取得癌组织标本的患者无法判断其HER2状态,并且无法进行跟踪随访,因此,国内外对于非侵入性的检测方法也在不断的研究当中。本课题通过免疫学方法检测血清HER2和外周全血PCR检测HER2 mRNA来评估HER2表达状态,探讨复发转移乳腺癌患者血清HER2水平及其化疗前后水平变化的临床意义;初步建立了HER2外周血实时定量RT-PCR检测方法,并对其和免疫学检测方法进行相关比较。方法免疫学检测方法如下:采集复发转移后首次治疗的乳腺癌患者化疗前和4周期化疗后2次血清和30例健康对照者1次血清标本,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清HER2 ECD水平。根据常用的HER2检测方法,将患者分为组织HER2阳性组和组织HER2阴性组,以组织HER2阳性组和健康对照组的血清HER2结果建立ROC曲线,确立最佳阳性界值,评价血清HER2检测方法和乳腺癌患者血清HER2水平和部分临床因素之间的关系,比较患者化疗前基础血清HER2水平与组织表达状态的关系,预测患者化疗前基础血清HER2水平对治疗疗效的影响及治疗前后血清HER2浓度变化与化疗有效率之间的联系。PCR检测方法如下:提取外周血标本中的总RNA,根据Genbank公布的HER2基因(GeneID:2064)找到其完整序列,通过BLAST和DNASIS软件比对分析找出人HER2的高度保守序列,应用DNASTAR软件设计的特异性的探针和引物,进行常规PCR扩增,应用扩增产物制备标准品并建立标准曲线,并对临床标本进行实时荧光定量PCR检测,HER2 mRNA水平是根据HER2/28S rRNA拷贝数的比值来确定HER2 mRNA的相对表达量,以组织HER2阳性组和健康对照组建立ROC曲线,确立最佳阳性界值,初步评估其方法和应用价值。对临床全血标本中提取的RNA进行Real-Time PCR技术检测。结果血清学检测结果:(1)利用ROC曲线确立血清HER2的最佳阳性界值为18.4ng/ml,在此阳性界值下血清HER2用来评估乳腺癌患者的HER2状态的敏感性为73.4%,特异性为86.1%。(2)复发转移乳腺癌患者的血清HER2与组织HER2表达状态相关,组织HER2阳性组的血清HER2水平显著高于组织HER2阴性组和对照组的血清HER2水平,具有统计学意义。(3)患者的血清HER2基础水平与患者对化疗的反应率无明显相关性。(4)化疗有效的患者,血清HER2水平下降,而化疗无效的患者血清HER2水平显著上升。实时荧光RT-PCR检测结果:(1)乳腺癌患者外周全血中提取的RNA在普通PCR和Real-Time PCR分析都获得较好结果。(2)建立了实时定量RT-PCR评估乳腺癌患者HER2 mRNA状态的技术平台,利用ROC曲线确立血清HER2的最佳阳性界值为5.95,并通过对临床标本进行分析,发现组织HER2阳性组的HER2 mRNA拷贝数显著高于组织HER2阴性组和健康对照组,具有统计学意义,实时定量RT-PCR评估复发转移性乳腺癌患者的敏感性为76.6%,特异性为91.6%。结论根据上述检测结果,可以认为:(1)复发转移乳腺癌患者的血清HER2基础水平与组织表达状态相关,可以作为组织检测方法的补充方法。(2)患者的血清HER2基础水平和患者的部分临床因素如年龄,绝经状态,ER,PR等无明显相关性。但与病人是否存在内脏转移有关。(3)患者的血清HER2基础水平不能判断辅助化疗疗效,但患者的化疗反应和血清HER2下降相关,可以作为一个生物学指标。(4)初步建立了Taqman Real-Time RT-PCR评估复发转移乳腺癌患者HER2 mRNA的方法,并应用于临床具有一定临床意义。(5)实时定量RT-PCR的敏感性和特异性都略高于免疫学检测方法。