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家蚕是一种重要的经济昆虫,具有巨大的经济价值,也是生物研究领域里较为理想的生物模型,值得深入研究。
与迪格奥尔格综合症相关的基因(简称DGCR6)并不是广泛存在于生物界的,目前只在动物界发现过该基因。在人、牛、小鼠、家蚕和果蝇等生物中的DGCR6基因已被克隆。序列比对分析结果表明,DGCR6基因在进化上非常保守。根据现有的研究,DGCR6多肽是一种功能并不明确的蛋白,推测其可能与诱发神经性疾病有关,如精神分裂症。本研究从家蚕蛹cDNA文库中筛选获得家蚕DGCR6基因cDNA序列,在E.col.BL21中表达融合蛋白,为进一步制备抗体与研究其在神经性疾病的作用奠定基础。我们将在家蚕蛹cDNA文库中发现的含有DGCR6结构域的基因命名为BmDGC6。该基因全长85.bp,ORF由534bp组成,其编码的氨基酸的残基序列与其他高等真核生物的同源性在30-40%之间,但与果蝇的同源性较高。将BmDGCR6基因cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有4个外显子,3个内含子。编码蛋白由177个氨基酸残基组成,分子量大小约为20.73kD。
有关家蚕DGCR6基因的报道尚未见。但我所在的实验室有家蚕cDNA文库,通过它我发现了该cDNA序列,并通过与NCBI上的其他物种DGCR6保守结构的比较,设计出合适的引物,扩增了该基因的ORF。PCR产物经Bam.I和XhoI双酶切后将DGCR6的CDS片段插入表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达质粒pGEX-4T-3/DGCR6,并转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经PCR、酶切鉴定证实重组正确。IPTG诱导表达目的蛋白表达并进行SDS-PAGE。SDS-PAGE分析结果显示在46kD附近可见清晰条带,与预计大小相符。该融合蛋白表达后是以包涵体的形式存在。通过割胶得到高纯度的目的蛋白,并用该蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了该重组蛋白的多克隆抗体,ELISA检测该抗血清的效价可达到1:12800以上。