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背景和目的矽肺是由于长期暴露于职业环境中游离二氧化硅(Silicondioxide,SiO2)含量较高的粉尘引起的以肺组织弥漫性纤维化为主要特点的全身性疾病,发病机制未被阐明且尚无特异治疗措施。巨噬细胞具有高度的可塑性,在不同微环境中易发生极化现象,不同亚型的巨噬细胞功能具有较大差异。研究表明,在特发性肺纤维化、肝脏纤维化及肾纤维化等纤维化疾病中,巨噬细胞极化具有重要调控作用。现已公认肺巨噬细胞是参与矽肺发病的重要效应细胞,但巨噬细胞极化在矽肺中的发生发展规律及其作用尚未见报道。因此,构建实验性矽肺模型,对矽肺不同阶段巨噬细胞不同亚型分布状况及其它生物学改变进行观察,研究巨噬细胞极化与矽肺的关联性、影响及其规律,为进一步深化对矽肺发病机制的认识提供参考依据。材料与方法取雄性C57BL/6小鼠(6-8周龄,18-22g)112只,随机分为实验组与对照组,每组56只。采用非暴露式气管滴注法,实验组滴注50μl SiO2粉尘悬液(50mg/ml,2.5mg/只小鼠),对照组滴注等量生理盐水。分别于染尘1、3、7、14、28、42、56天后处死小鼠,每组8只。收集肺泡灌洗液和肺组织。HE和Masson染色分别观察小鼠肺组织的炎性浸润、胶原沉积和结构变化;流式细胞术检测肺泡灌洗液及肺组织中巨噬细胞M1/M2亚型的比例;免疫组织化学法检测M1/M2巨噬细胞在肺组织中的分布及含量;ELISA法检测肺泡灌洗液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β1的含量;qRT-PCR法检测肺组织中纤维化标志α-SMA、Collagen I,M1/M2巨噬细胞标志iNOS、CD86、Arg1、CD206,细胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10、TGF-β1、VEGF,趋化因子CCL2、CCL3、CCL4,基质金属蛋白酶MMP2、MMP9、MMP28,调控巨噬细胞极化相关信号通路分子STAT1、STAT3、STAT6、IRF3、IRF5、NF-κB p65、PPAR-γ等mRNA的相对表达水平;Western blot检测肺组织中纤维化标志α-SMA、Collagen I,M1/M2巨噬细胞标志iNOS、CD206,调控巨噬细胞极化相关信号通路分子 STAT1、STAT3、STAT6、IRF3、IRF5、NF-κB p65、PPAR-γ等蛋白表达水平。统计学分析使用SPSS21.0统计软件进行。数据均以x±s表示,两组独立样本间的统计分析方法采用Student’s t检验,三组及以上独立样本间的统计分析方法采用单因素方差分析(ANOVA)。检验水准α=0.05。结果1.小鼠矽肺模型的构建结果染尘7天后,可见肺泡壁增厚,肺泡腔中出现炎性细胞浸润,肺泡完整性受到一定程度的破坏;28天后,细胞性结节开始出现,肺组织逐渐发生纤维化病变;56天后,肺组织结节逐渐增大,数量显著增加,肺泡结构受到严重破坏。随着染尘时间的增加,小鼠肺部胶原沉积逐渐增加,纤维化标志分子α-SMA和Collagen I的mRNA及蛋白水平均升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.小鼠肺组织及肺泡灌洗液中巨噬细胞亚型检测结果与对照组相比,肺泡巨噬细胞(AM)M1型的比例在染尘后明显升高,染尘14天后达到峰值,随后逐渐降低;M2型的比例在染尘14天内无明显变化,且低于对照组,14天后显著升高,比例超过对照组,随后逐渐降低,M1型所占比例在染尘28天前均大于M2型,随后二者比例持平。肺间质巨噬细胞(IM)M1型的比例在染尘后显著升高,染尘14天后达到峰值,随后逐渐降低,与肺泡巨噬细胞变化趋势基本一致;M2型的比例在染尘42天后开始升高,持续升高至第56天,M1/M2比值的变化趋势与肺泡巨噬细胞基本一致。M1型巨噬细胞主要分布于肺组织炎性浸润部位,M2型巨噬细胞在结节与纤维化部位大量存在。M1标志iNOS及CD86,M2标志CD206及Arg1在肺组织中表达水平的变化趋势与流式细胞仪检测结果基本一致。3.小鼠肺组织及肺泡灌洗液中细胞因子、趋化因子及基质金属蛋白酶的检测结果染尘后,肺组织中的炎性细胞因子TNF-α和IL-6的mRNA水平明显升高,14天后开始下降,而IL-1β在14天时开始升高,28天达到峰值,随后逐渐降低;免疫抑制因子IL-10的表达在染尘初期被抑制,随后至第56天呈逐渐升高。肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β细胞因子水平在染尘后均升高至28天,随后逐渐降低但仍高于对照组;IL-10在染尘1天后明显升高,随后迅速降低,7天后开始升高直至第56天。肺组织中趋化因子CCL3和CCL4的表达水平在染尘初期(7天内)升高,随后降低至正常水平;基质金属蛋白酶MMP2和MMP28的表达在染尘后被抑制,直至42天时开始升高。4.小鼠肺组织STAT/IRF信号通路活化状态的检测染尘后,STAT/IRF信号通路相关指标的mRNA及蛋白表达水平变化趋势观察结果发现,IRF5的表达水平随着染尘时间增加而逐渐降低;而IRF3、PPAR-γ的表达水平随着染尘时间增加逐渐升高。结论矽肺发生发展过程中存在巨噬细胞极化现象。M1型巨噬细胞主要存在于早期,可能具有促进炎症反应发生的作用;M2型巨噬细胞主要存在于后期,可能具有消除炎症反应、修复组织损伤而促进纤维化的作用。STAT/IRF信号通路可能参与调控矽肺中的巨噬细胞极化。