研究背景:视网膜神经节细胞(RGCs)将视觉信号传入大脑,但是神经损伤或疾病(如青光眼)总是会导致神经元的死亡和视功能的丧失。成年哺乳动物视神经损伤后RGCs的轴突很难再生。要修复受损的视神经必须保护神经元的存活和促进轴突的再生。色素上皮衍生因子(PEDF)是一种具有抗血管生成、神经营养和神经保护作用的蛋白,能够保护神经元免受多种病理性的损害。另外它还具有抗炎能力。当视神经损伤时晶状体同时损伤,许多RGCs可以存活,而且其轴突再生进入远端视神经。晶状体损伤可以诱导巨噬细胞活化,巨噬细胞能够分泌多种刺激RGCs轴突再生的细胞因子。巨噬细胞在这个过程中似乎起关键作用,因为单独玻璃体注射酵母多糖而没有晶状体损伤,也可以诱导RGCs轴突再生进入远端视神经,而酵母多糖可以刺激组织的单个核细胞。目的:本研究探讨联合两种方法,即PEDF联合巨噬细胞条件培养液(MCM)或晶状体损伤是否能协同保护RGCs的存活和促进RGCs轴突的再生。方法:1.细胞培养:培养出生24 h的SD仔鼠的RGC细胞以及SD大鼠腹腔巨噬细胞,观察它们的形态、进行免疫组化鉴定,用MTT法绘制它们的生存曲线,揭示它们的培养规律。2.细胞实验:(1)巨噬细胞与酵母多糖共培养,观察培养液中血清对巨噬细胞吞噬酵母多糖颗粒的影响。(2)制备细胞爬片及MCM,观察联合应用PEDF和MCM对培养的RGC细胞的存活数和轴突再生长度的影响。3.动物实验:(1)将荧光金注射到SD成年大鼠及出生2 w的SD幼鼠脑内,逆行性标记RGC细胞,观察RGCs的分布规律和细胞数目。(2)制备视神经损伤模型和晶状体损伤模型,观察联合应用玻璃体注射PEDF和晶状体损伤对视网膜RGC细胞的存活数、视神经轴突再生以及GAP-43 mRNA表达的影响。结果:1.细胞培养:(1)成功培养了SD大鼠RGC细胞,GAP-43呈阳性,培养第4 d时,有71.4%细胞存活,而到第6 d时,大量细胞开始死亡,46.3%细胞存活,第8 d时,只有7.1%细胞存活。(2)成功培养了SD大鼠腹腔巨噬细胞,CD68呈阳性,可以存活2 w左右,在培养第8 d时,约有一半细胞死亡。2.细胞实验:(1)巨噬细胞同酵母多糖共培养2 d,血清组细胞数多于对照组(P<0.01)。(2)观察对RGCs存活数目的影响: MCM组在细胞培养第3 d时细胞数目为31.4±3.7(P<0.05),PEDF联合MCM组为34.7±4.2(P<0.01),而对照组为27.6±2.2,与对照组均有显著统计学差异。PEDF联合MCM组的细胞数大于MCM组,两者有显著统计学差异(P<0.05)。对RGC轴突再生的影响:细胞培养第3 d时,MCM组细胞轴突长度为57.6±3.7μm,PEDF联合MCM组的细胞轴突长度为88.6±9.5μm,与对照组(41.8±5.4μm)均有显著统计学差异(P<0.01)。PEDF联合MCM组的轴突长于MCM组(P<0.01)。3.动物实验:(1)成功制备荧光金逆标模型,RGCs密度为2219±113 RGC / mm2。(2)玻璃体注射PEDF联合晶状体损伤可以大幅提高视神经损伤后RGCs存活数目。与单独应用玻璃体注射PEDF或晶状体损伤相比,两者联合可以增加RGCs总存活数(1411±84 RGC/mm2),与前两者均有显著统计学差异(P < 0.01)。单纯的晶状体损伤能够刺激远端的RGCs轴突再生,PEDF联合晶状体损伤能够强烈刺激远端视神经轴突再生,与晶状体损伤组有显著统计学差异(P<0.01)。PEDF联合晶状体损伤在同一时间点可以大幅提高视神经损伤后GAP-43 mRNA的表达,与两者单独进行干预均有显著统计学差异(P < 0.01)。结论:1.血清能够刺激巨噬细胞的吞噬功能。2.单独应用PEDF不能保护培养的RGC细胞存活以及促进轴突再生, MCM能保护RGC细胞存活以及促进轴突再生,与PEDF可以协同保护RGC细胞存活以及促进轴突再生。3.玻璃体内注射PEDF和晶状体损伤都可以增加RGCs存活数目,两者可以协同使这一作用增加。晶状体损伤可以刺激轴突再生,联合PEDF可以增强刺激再生作用。晶状体损伤和PEDF都能提高GAP-43 mRNA的表达,两者联合使这一作用加强。创新点:1.首次观察幼鼠荧光金逆行性标记RGCs。2.首次探讨PEDF对培养RGCs轴突再生和视神经损伤修复的作用。3.首次探讨联合PEDF和MCM或晶状体损伤对视神经夹伤后RGCs的存活和促进RGCs轴突再生的影响。