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研究背景:化疗耐药是绝大多数肿瘤治疗失败的主要原因之一。在化疗中,肿瘤细胞可以通过某些基因的变化而逃避化疗药物的杀灭作用,最终形成肺转移并导致患者死亡。在前期研究中,我们已从荷瘤鼠肺转移灶中成功分离骨肉瘤细胞亚群Saos2-lung,本研究拟以此为主要研究对象,比较分析骨肉瘤细胞化疗抵抗的分子机制,为骨肉瘤的治疗提供新的干预靶点。目的:分析骨肉瘤细胞化疗抵抗的分子机制,发现增强骨肉瘤细胞化疗敏感性的新方法,并通过动物实验验证其干预效果。方法:1.对骨肉瘤细胞化疗敏感性的分析:选择骨肉瘤细胞系Saos2和Saos2-lung作为研究对象。对两种细胞采用顺铂和阿霉素进行处理,用CCK-8法和流式细胞术检测细胞活力和细胞凋亡;同时用Western Blot检测CXCR1的表达。另外选取两种常见的骨肉瘤细胞系U2OS和MG63验证化疗敏感性与CXCR1表达的关系。2.CXCR1基因抑制对骨肉瘤细胞化疗敏感性的影响及分子机制研究:用两组shRNA的慢病毒载体对Saos2和Saos2-lung细胞进行CXCR1基因的抑制,无效shRNA转染作为对照,在嘌呤霉素的筛选下获得稳定表达细胞系。分析基因抑制前后骨肉瘤细胞对顺铂的化疗敏感性及在IL-8作用下的变化;Western blot检测CXCR1、p-Akt以及凋亡标志蛋白Caspase-3表达的差异。其次,选取对顺铂化疗抵抗能力较强的U2OS骨肉瘤细胞系进行CXCR1基因的抑制,检测抑制前后顺铂化疗敏感性的变化。3.CXCR1基因抑制对荷瘤鼠化疗敏感性的影响:将荧光标记的CXCR1基因抑制的Saos2-lung细胞和对照细胞注入裸鼠胫骨髓腔内,建立骨肉瘤原位模型,给予化疗药物顺铂进行治疗,观察裸鼠的肿瘤大小以及荧光信号变化。动物处死后取骨肉瘤标本,免疫组化检测IL-8、CXCR1、p-Akt、Cleaved-Caspase-3以及PCNA的表达。结果:1.骨肉瘤细胞化疗敏感性的分子标志:检测发现Saos2-lung细胞比Saos2细胞具有更强的针对顺铂和阿霉素的化疗抵抗能力。经Western Blot证实Saos2-lung细胞高表达趋化分子CXCR1。CXCR1高表达的U2OS细胞比MG63细胞也具有更强的化疗抵抗能力。2.CXCR1基因抑制后骨肉瘤细胞化疗敏感性的变化及信号调节机制:Western Blot证实,已建立在Saos2和Saos2-lung细胞中稳定抑制CXCR1表达的细胞系。CXCR1基因抑制后骨肉瘤细胞对顺铂的化疗敏感性大大增强;IL-8提高骨肉瘤细胞对化疗药物的抵抗能力,抑制CXCR1后可阻断IL-8的刺激效应;Western Blot检测发现IL-8可激活骨肉瘤细胞内Akt信号通路,CXCR1表达抑制后此信号通路也被抑制,Cleaved-Caspase-3表达上调。对U2OS细胞进行CXCR1基因抑制也可增强其化疗敏感性。3.CXCR1基因抑制细胞在体内的化疗敏感性变化:活体成像监测表明,CXCR1基因抑制细胞在体内对顺铂的化疗敏感性增强,荷瘤鼠肿瘤生长延缓。免疫组化染色显示IL-8、CXCR1、p-Akt和PCNA在CXCR1基因抑制组中被抑制,而Cleaved-Caspase-3表达升高。结论:CXCR1高表达与骨肉瘤细胞化疗抵抗相关,CXCR1基因抑制可增强骨肉瘤细胞对顺铂的化疗敏感性,降低骨肉瘤的体内生长能力,其作用机制可能与阻断IL-8/CXCR1/Akt信号通路有关。CXCR1有望成为骨肉瘤治疗的新靶点。