小鼠和人类在基因组的大小,基因的数目以及基因组的结构等方面具有很大程度的相似性。很多基因在小鼠和人类中具有高度的保守性,因此,可以利用小鼠基因敲除模型来研究人类基因的功能,从而为人类疾病的治疗提供理论基础。在小鼠里,传统的基因打靶方法需要构建同源打靶载体,电转小鼠ES细胞,经过正负筛选,找出正确的克隆,注射到小鼠囊胚中,得到的嵌合小鼠需要把这种正确的打靶遗传到下一代,才算成功得到基因打靶小鼠,整个过程耗时1-2年,需要多个操作步骤,成本很高。因此,新的不依赖ES细胞、高效安全的基因编辑方法亟待开发。TALEN是由TAL effector及Fok1融合而成,TAL effector是在黄单胞杆菌中发现的一种转录激活样的效应因子,其蛋白比较特殊,中间部位是由重复序列RVD组成,每个RVD都由34个氨基酸构成,只有第12和13位的氨基酸不同,正是这两个氨基酸的不同,导致每种RVD可以识别不同的碱基,多个RVD串联起,就可以识别多个碱基,融合Fok1的TALEN形成dimer后,会切割DNA,造成DSB。传统构建TALEN质粒的方法存在一些不足,例如Golden Gate法用于构建TALEN质粒顺利的话至少要花费5天的时间才能得到正确的克隆,并且需要重复的进行挑克隆,PCR验证的步骤,耗时耗力。这里,我们成功地构建出了一套TALEN文库用于快速高效地构建TALEN质粒。与Golden Gate法相比,减少了一半的时间,简化了操作步骤,更加有利于TALEN技术的广泛使用。并且,利用这套TALEN文库系统,我们成功地得到了Cntn 基因敲除小鼠。同样,CRISPR/Cas9系统也是一种新颖的基因组改造工具,它来源于细菌和古细菌的获得性免疫系统,用以对抗入侵的病毒和质粒。Type Ⅱ CRISPR/Cas系统是三个类型中最为简单的一个,由CRISPRRNAs(crRNAs),trans-activating crRNAs(tracrRNAs)和 Cas9 DNA 内切酶组成。成熟的 crRNAs:tracrRNA 复合物指导Cas9对双链DNA的切割。为了简化这个系统,将crRNAs和部分tracrRNA融合成一条嵌合的sgRNA链。目前,CRISPR/Cas系统已经成功地应用于人类细胞和许多模式生物的基因组改造。这里,我们利用CRISPR/Cas9系统特异性地敲除HBV cccDNA。为了提高系统的特异性,我们使用CRISPR/Cas9切口酶和成对的sgRNAs,两个相近的切口可以造成DNA双链断裂,诱导细胞发生非同源末端连接修复,引入突变,而脱靶位点几乎只会形成一个切口,但是基因组上的切口可以通过碱基切除修复方式完美修复。我们针对HBV设计了四对sgRNAs,在293T和HepG2细胞中共转染Cas9,成对的sgRNAs和HBV表达载体payw1.2质粒。payw1.2质粒含有1.2个HBV基因组拷贝,转染后它可以在293T及HepG2细胞中转录出所有的病毒RNAs,翻译出病毒蛋白。转染3天后通过ELISA检测培养液上清中乙型肝炎病毒表面抗原的表达量降低了 90%。通过MTT实验,在转然后48小时,我们发现CRISPR/Cas9系统对细胞几乎没有任何毒性。这些数据表明CRISPR/Cas9系统可以在体外特异性地敲除HBV复制模板cccDNA,预示着CRISPR/Cas9系统具有清除HBV感染的潜能。