研究背景和目的：人感染高致病性禽流感病毒H5N1（Influenza A virus subtypeH5N1）具有发病迅猛、高致死率的特点。目前普遍认为，体内高病毒载量及过度的炎症反应造成免疫病理损伤是禽流感病毒（AIV）主要的致病机制。AIV通过其表面膜蛋白－血凝素(HA)与靶细胞如呼吸上皮细胞的相应受体结合而感染侵入细胞，这一过程诱导了细胞因子及趋化因子的大量释放，进而活化并募集单核-巨噬细胞、淋巴细胞与中性粒细胞等炎症细胞至感染部位，导致严重的弥漫性肺损伤，引起一个类似急性呼吸窘迫综合症的病理生理改变以及继发的全身多器官免疫炎症综合症。　　Janus蛋白酪氨酸激酶(JAKs)是细胞因子信号转导过程的门卫，控制着大量细胞因子信号转导，因此在获得性和固有免疫中扮演着核心的角色。前期我们已证实：H5N1的HA能作为“Pathogen associated molecular pattern”(PAMPs)，通过结合并激活细胞膜上存在的“pattern recognition receptors”(PPRs)，例如Toll like receptors(TLRs)，启动宿主固有免疫应答JAK/STAT与NF-κB信号通路，导致早期失控的宿主肺的免疫炎症反应。我们发现其关键的控制子是胞浆酪氨酸激酶家族的JAK3。我们还揭示了禽流感病毒HA通过激活呼吸上皮细胞JAK3抑制了腺苷酸环化酶（AC）使cAMP依赖的CFTR－氯离子通道开放受阻；进一步活化 NF-κB信号，加剧了病理性免疫炎症反应。与此同时我们也鉴定出中药单体阿魏酸具有对cAMP依赖的CFTR－氯离子通道激活的调节作用。　　上皮细胞特异性类ETS转录因子1（ESE-1）是一种上皮细胞特异性的转录因子，在细胞的增殖、分化、凋亡、转移等多种过程中起着重要的调节作用。目前已经证实ESE-1在LPS、TNF-α和IL-1β等细胞因子的刺激下表达增高并激活下游基因，而且有报道在肺上皮细胞中ESE-1可以受到NF-κB信号通路的调节[1]。细胞间粘附分子1（ICAM-1）是一种分布于内皮细胞及上皮细胞表面的糖蛋白，它可以调节细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互结合并起到粘附迁移的作用。ICAM-1也是多种病毒的受体。肺上皮细胞的ICAM-1表达上调有利于中性粒细胞粘附于细胞表面，可进一步促进肺组织损伤及持续性细胞因子释放。在多种急性肺损伤模型中，抗ICAM-1的抗体可以起到降低肺损伤严重程度的作用。我们之前也发现H5N1的HA能够刺激呼吸道上皮细胞增加ICAM-1合成释放。综上可见，深入阐释H5N1病毒HA蛋白对上皮特异转录子ESE-1与ICAM-1基因表达关系的影响，以及调控的信号机制，并研究阿魏酸可能的干预作用，将为临床上治疗H5N1禽流感病毒引起的急性肺损伤提供新思路与理论依据。　　研究内容和方法：　　第一部分H5N1病毒重组HA蛋白激活JAK-STAT信号对上皮特异转录因子-ESE-1表达的影响及其对ICAM-1基因转录的调控作用　　应用JAK3抑制剂（760nmol/L）或STAT1干扰RNA处理A549细胞，然后给予HA（80μg/ml）刺激，免疫印迹法检测观察P-JAK3、JAK3、P-JAK2、JAK2、P-JAK1、JAK1、P-STAT1、STAT1、P-STAT2、STAT2、ESE-1及ICAM-1的表达变化，调查H5N1病毒重组HA蛋白激活肺泡II型上皮细胞JAK-STAT信号转导对ESE-1及ICAM-1表达的影响。采纳ESE-1干扰RNA腺病毒载体干扰ESE-1的表达，检测ESE-1表达对ICAM-1基因转录及蛋白表达的影响。应用含有ICAM-1启动子序列的荧光素酶报告载体，通过与ESE-1表达载体共转染细胞观察验证ESE-1作为转录因子对ICAM-1基因启动子的激活调节作用。使用CFSE标记的HL-60细胞与转染了ESE-1干扰RNA的A549细胞共孵育，荧光显微镜下观察黏附的HL-60细胞数，评价肺上皮细胞对HL-60细胞的粘附功能变化。　　第二部分阿魏酸对H5N1病毒重组HA蛋白介导的JAK3-STAT1信号激活依赖的ESE-1和ICAM-1过表达的影响及其对急性肺损伤的作用　　应用阿魏酸（250μM）干预合并HA（80μg/ml）刺激检测A549细胞中ESE-1及ICAM-1，P-JAK3和P-STAT1的蛋白表达，同时检测培养上清液中趋化因子与ICAM-1等的表达量。体内试验采纳C57B6小鼠，分别使用HA（100μg/只）雾化吸入或HA吸入合并阿魏酸（40mg/kg）腹腔注射，36h后处死，HE染色及ESE-1、ICAM-1组化染色，观察小鼠肺部损伤程度及ESE-1、ICAM-1的表达分布情况。　　结果：　　第一部分 H5N1病毒HA蛋白诱导ESE-1及ICAM-1转录激活依赖JAK3-STAT1信号转导　　相对于对照组，经HA刺激的A549细胞JAK3、STAT1的磷酸化水平显著增高，并伴随ESE-1和ICAM-1蛋白的表达增高；JAK3抑制剂或STAT1干扰RNA预处理均可下调HA刺激诱导的ESE-1及ICAM-1表达。相对于空载体转染，转染干扰ESE-1RNA表达载体的A549细胞其ICAM-1表达水平明显降低；荧光素酶报告实验发现在转染了ESE-1表达质粒后的24h及48h，ICAM-1启动子荧光素报告载体的荧光值相对于转染了空载质粒对照组有明显增高。细胞粘附实验发现相对于ESE-1空载对照组，ESE-1干扰组A549细胞粘附的HL-60细胞数明显减少。　　第二部分阿魏酸可抑制H5N1病毒HA蛋白诱导的JAK3-STAT1信号转导激活，下调ESE-1及ICAM-1表达并减轻急性肺损伤　　相对于HA刺激对照组，阿魏酸干预后给予HA刺激组其ESE-1、ICAM-1、磷酸化JAK3及磷酸化STAT1的蛋白表达水平明显降低；伴随着HA刺激下的趋化因子与ICAM-1生成分泌水平的显著下调。小鼠肺组织免疫组化染色显示：应用阿魏酸干预组HA雾化刺激诱导的肺细支气管内皮中ESE-1和ICAM-1高表达明显抑制；肺实质炎症细胞浸润与损伤程度减轻。　　结论：　　1. H5N1禽流感病毒HA蛋白可以通过激活呼吸上皮细胞JAK3-STAT1信号转导通路诱导ESE-1和ICAM-1的表达。　　2.呼吸上皮细胞在炎症细胞因子刺激下可以诱导上皮特异转录因子 ESE-1蛋白与ICAM-1的启动子序列结合，激活ICAM-1基因转录上调ICAM-1的表达。　　3.阿魏酸可抑制 HA诱导的肺上皮细胞 JAK3-STAT1通路的激活，进而降低ESE-1蛋白的活化下调ICAM-1基因过表达，减少免疫细胞在肺上皮的粘附聚集。　　4.阿魏酸通过抑制HA诱导的JAK3-STAT1的激活减少肺上皮细胞趋化因子的分泌，进而减轻肺部免疫细胞的募集。