论文部分内容阅读
背景与目的重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是一种T细胞依赖的抗体介导的自身免疫性疾病,临床主要特征是由于神经肌肉处传递障碍引发的肌肉无力,是反复发作的慢性迁延性疾病。研究表明,重症肌无力的发病和确诊率在逐年上升。小于40岁的人群中年发病率没有明显变化,超过60岁时年发病率会随着年龄的增长逐步上升,而且多见男性。MG如果不加以治疗,将有20%-30%的病人在10年内死亡。胸腺与重症肌无力的发病密切相关,MG患者胸腺组织常伴发异常增生和胸腺瘤,因此,胸腺切除仍是目前临床常用的治疗手段。研究认为重症肌无力的发病存在年龄、胸腺变化和肌无力分布的异质性,也与遗传因素有关,但其发病机制仍不十分清楚。人趋化因子CCL25,又称为胸腺表达的趋化因子(thymus-expressed chemokine,TECK),在胸腺中主要由胸腺上皮细胞和树突状细胞产生。CCR9是目前发现的CCL25唯一受体,可表达于胸腺细胞、B细胞、肠上皮内淋巴细胞等。CCR9是介导骨髓的胸腺前体细胞向胸腺归巢的重要分子。我们课题组前期基因芯片的结果显示,MG患者胸腺组织CCL25及其受体CCR9的表达均高于正常对照组。因此认为CCL25在胸腺基质细胞的过表达可能与MG的发生有关。本研究利用基因工程技术构建人CCL25慢病毒载体,并体外感染原代分离的人胸腺上皮细胞(TEC),分析CCL25过表达对TEC的趋化功能、抗原递呈功能和对胸腺细胞诱导分化作用的影响,探讨CCL25过表达与重症肌无力的关系。方法正常TEC和MG-TEC分别由手术切除先天性心脏病患者和重症肌无力患者胸腺组织获得,采用胶原酶Ⅳ消化法分离,并利用细胞角蛋白CK8/18单抗、表皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,Ep CAM)单抗进行免疫组化染色鉴定,液氮冻存备用。分别选取MG和正常胸腺分离的两组TEC细胞,对正常组TEC进行CCL25慢病毒感染,分析MG组TEC和CCL25慢病毒感染组TEC与对照组相比的细胞特性。1.构建表达人趋化因子CCL25基因的慢病毒载体,鉴定病毒感染效果。2.慢病毒载体感染正常人胸腺上皮细胞(TEC),提取各组细胞总RNA,采用荧光定量PCR法检测趋化因子CCL5、CCL19、CCL21、CXCL10、CXCL12,黏附分子P-selectin、ICAM-1、VCAM-1、HLA-1和HLA-2,Notch信号通路中的四种notch配体(DLL1、DLL4、JAG-1、JAG-2)和IL-7的m RNA的表达水平,用2-ΔΔCt法分析感染组与对照组TEC、MG组与对照组TEC各基因的相对表达差异。3.P-selectin、ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达情况:提取各组细胞总蛋白,通过Western blot法检测P-selectin、ICAM-1、VCAM-1蛋白表达水平,分析CCL25感染组、MG组与对照组TEC三种蛋白表达量的差异。4.检测细胞因子IL-7在CCL25慢病毒感染组、MG组和正常对照组细胞培养上清中蛋白的表达情况:将TEC铺于24孔板中,慢病毒感染72小时后,用ELISA法检测各组细胞培养上清中IL-7的蛋白浓度,比较感染组与对照组TEC、MG组与对照组TEC细胞培养上清中IL-7蛋白量的差异。5.统计学分析:结果以均数±标准差表示,采用SPSS 20.0统计软件进行t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.CCL25慢病毒重组载体质粒的构建与鉴定:带有酶切位点的CCL25基因片段经Xba I、Eco RI双酶切后琼脂糖凝胶电泳显示400bp-500bp之间有单一条带;p CD513B-1质粒经双酶切后电泳结果显示质粒线状化。对重组载体质粒p CD513B-1-CCL25进行菌落PCR和测序鉴定,鉴定结果证明慢病毒重组载体质粒构建成功。2.收集浓缩的慢病毒液,测定病毒滴度约为4×108Tu/ml。3.病毒感染效果的鉴定:荧光定量PCR、western-blot和ELISA方法分别检测TEC的CCL25转录、表达和分泌水平,与对照组相比,感染后CCL25的表达和分泌显著增加(P<0.05)。4.荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,CCL25表达感染组CCL5、CXCL10、CCL19、P-selectin、ICAM-1、VCAM-1和IL-7表达明显增高(P<0.05),CCL21、CXCL12、HLA-A、HLA-DR和Notch配体(DLL1、DLL4、JAG-1、JAG-2)表达无显著变化(P>0.05);MG组CCL5、CXCL10、P-selectin、ICAM-1、VCAM-1和IL-7表达量显著增加(P<0.05),CCL19、CCL21、CXCL12、HLA-A、HLA-DR和Notch配体未见显著差异(P>0.05)。5.Western blot检测P-selectin、ICAM-1和VCAM-1蛋白表达量:与对照组相比,P-selectin、ICAM-1和VCAM-1蛋白在感染组和MG组表达均明显增高(P<0.05)。6.细胞培养上清中IL-7含量的检测:慢病毒感染72小时,采用ELISA法检测IL-7蛋白含量。与对照组相比,感染组和MG组培养上清中IL-7蛋白含量均显著增加(P<0.05)。结论人胸腺上皮细胞过表达CCL25基因会引起IL-7分泌的增加,上调粘附分子VCAM-1、ICAM-1及P-选择素的水平,进而影响TEC的抗原递呈功能。