乳二糖（lacto-N-biose,LNB）是母乳寡糖中的重要组成部分,也是双歧杆菌维持生命活动的重要底物,它在促进婴幼儿肠道中双歧杆菌的定植和增殖中起重要作用。双歧杆菌可以通过乳二糖磷酸化酶（lacto-N-biose phosphorylase,LNBP）来代谢LNB获得生命活性所需要的能量。LNBP（EC2.4.1.211）是一种可逆的磷酸化酶,可以催化LNB和GNB（galacto-N-biose）产生N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）,N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）和β-D-半乳糖-1-磷酸（Gal 1-P）。Wada等证实双歧杆菌中具有编码代谢LNB的基因簇,其中LNB通过特定的ABC型转运蛋白转运至细胞质,它由LNBP最终在糖酵解和氨基糖代谢途径中代谢。从长双歧杆菌JCM 1217（Bifidobacterium longum JCM1217）克隆乳二糖磷酸化酶基因,将该基因与载体pET28a连接构建了重组表达质粒pET28a-LNBP,将pET28a-LNBP转化到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中构建了重组工程菌株E.coli BL21/pET28a-LNBP。另外,该基因与pHT43载体连接构建了重组表达质粒pHT43-LNBP,将pHT43-LNBP转化到枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB800N中,构建了重组工程菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP。在优化这两种表达系统的表达条件的基础上,对比分析了两种表达系统对乳二糖磷酸化酶的表达情况。此外,使用Ni-NTA纯化重组乳二糖磷酸化酶,并进行部分酶学性质分析,实验结果如下:1.重组菌E.coli BL21/pET28a-LNBP表达乳二糖磷酸化酶的最佳初始菌密度为OD600=0.5、IPTG的最终浓度为0.1 mmol/L、诱导表达温度为30℃、诱导表达时间为18h、振荡培养的最佳转速为180 rpm。经以上条件培养重组菌E.coli BL21a/pET28a-LNBP后,获得的LNBP总酶活达353.94U/L,比活力为15.18U/mg。2.重组菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP表达乳二糖磷酸化酶时的最佳初始菌密度OD₆₀₀=0.5、0.1 mmol/L为IPTG的最终浓度、37℃为最适的诱导表达温度、9h为最适的诱导表达时间、120 rpm为振荡培养的最佳转速。经以上条件培养重组菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP后,获得的LNBP总酶活为778.82U/L,比活力为31.36U/mg。3.用Ni-NTA纯化重组的乳二糖磷酸化酶,用含有200 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白,具有良好的纯化效果。酶学性质分析结果表明,重组乳二糖磷酸化酶的最佳反应温度为20℃,最适pH为7。4.本论文通过对重组菌E.coli BL21/pET28a-LNBP和重组菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP的诱导表达条件的优化,结果显示,枯草芽孢杆菌相对于大肠杆菌显著地提高了重组乳二糖磷酸化酶的比活,为工业化生产乳二糖磷酸化酶提供了技术支持与指导。